鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类机制研究和同源性分析.pdfVIP

一478一 第三届全国细菌耐药监测与临床专题学术会议 鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类机制研究和同源性分析 罗柳林应春妹倪培华 叶杨芹 汪雅萍张灏曼 于嘉屏 鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii， 3．主要仪器：Eppendorf低温高速离心机， Ab)是不动杆菌属中最常见的一种革兰阴性球杆 ABl7000实时定量PCR仪，宁波新芝超声破碎仪， 菌，该菌广泛分布于医院环境中，是一种重要的 日立低温超速离心机，琼脂糖凝胶电泳仪和天能 机会致病菌，能引起一系列院内感染，如茵血症、 凝胶成像仪，Bio-Rad蛋白电泳仪。 尿路感染、继发性脑膜炎、呼吸机相关性肺炎等。 二、方法 尤其对碳青霉烯类抗生素的耐药已经高达25％[1]， 1．抗生素药物敏感试验：纸片扩散法，根据 最近报道对多粘菌素和替加环素的耐药使得目前 2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标 对这种难治细菌已经没有药物可以选择[2]。 准判断药敏结果。用Whonet5．1软件进行数据 本文将从碳青霉烯酶水解酶、膜孔蛋白等并 处理。 结合同源性分析来了解耐碳青霉烯类抗生素鲍曼 2．同源性分析：应用REP-PCR引物进行扩 增，其反应体系为(z5 不动杆菌的耐药机制及其流行型别。 pI)：5×缓冲液5肛l， Mg+(3mmol／L)3IIl，dNTPsmixture(各2．5 材料与方法 一、材料 5’一mGCGCCGICATCAGGC_3’，PZ51_ACGTCT— TATCAGGCCTAc-3 1．菌株来源：收集2007年上海仁济医院、上 7。循环条件是：94℃变性1 海瑞金医院和上海市第六人民医院的非重复耐亚 rain，40℃退火1min，65℃延伸8min，重复35 胺培南和美罗培南菌株51株和对亚胺培南和美罗 个循环。 培南敏感的35株鲍曼不动杆菌。 3．PCR扩增检测：用生工革兰阴性菌DNA基 2．药敏纸片和试剂：阿米卡星、庆大霉紊、 因组提取试剂盒制备模板，引物由上海闪晶生物 氨苄西林、氨苄西林／克拉维酸、哌拉西林、头孢 有限公司合成，PCR扩增所用引物见表1，其反应 唑林、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢拉 体系均为(zo t-d)；5x缓冲液4弘l，M92+(2 定、亚胺培南、环丙沙星、复方新诺明、头孢哌 retool／L)1．6lIl，dNTPsmixture(各2．5retool／ 酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦、头孢吡肟、美 s， 罗培南、头孢丙烯等18种抗生素均购于OXOIDTaq酶0．2肛l(1U)。反应条件为：94℃变性30 公司；DNA提取试剂盒购自上海生工；DNA DL2000 Marker购自Takara公司；PCR试剂为VIM)／60℃(IMPl和IMP4)退火45s，72℃延 伸lmin，重复30个循环。 Promega公司；细菌混合性蛋白酶抑制剂(cock- tail)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)和蛋白酶抑制剂4．测序：PCR扩增产物由上海闪晶生物有限 (PMSF)购自Sigma公司，微量蛋白定量试剂盒 为Pierce公司，Acr／Bis购自上海闪晶生物有限比对以确定基因型别。 公司。 30ml