杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验.docVIP

杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验 从海洋或淡水体的污泥中分离水生放线菌，以鳗弧菌和肠型点状气单孢菌，这两种典型病害菌为指示菌，筛选杀菌放线菌，并初步鉴定。 1.指示菌：鳗弧菌和肠型点状气单孢菌 中科院水生生物研究所提供 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 实验室保存种 2.放线菌株分离纯化： 从不同地区海洋或淡水体的污泥样品，取3g加入30mL无菌去离子水中，震荡20-30min，梯度稀释至10-2、10-3、10-4 ，涂布于高氏1号平板（培养基中加入0.0075℅重铬酸钾，抑制细菌和真菌），28℃培养7d.挑不同形态的单菌落到高氏1号斜面培养，将菌落在平板上反复划线纯化得纯培养物，4℃冰箱保存。 分离出86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。 3.放线菌株的筛选： 3.1初筛：将纯化菌株接种于改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养8d.用无菌钻孔器打成5mm的琼脂块。取指示菌0.1ml涂布于普通琼脂平板，挑取打好的放线菌琼脂块反贴到已涂指示菌的平板上，鳗弧菌和肠型点状气单孢菌在28℃培养， 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。 琼脂扩散法抑菌试验表明：19株淡水放线菌具有抑菌活性，32株海洋放线菌具有活性，故海洋放线菌产生抗菌物质比例高。对初筛活性强的7株海洋和3株淡水放线菌加入复筛。 3.2复筛：有较强抗菌能力的放线菌接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃ 140r/min培养8d，取指示菌0.05ml涂布于普通琼脂平板，用无菌打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05ml注入孔中，培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。获得较好的海洋放线菌4株，淡水放线菌2株，其抗菌活性测定结果表： 六株放线菌抗菌活性测定结果（抑菌圈直径） mm 鳗弧菌 肠型点状 大肠杆菌 金黄色葡 菌株 产气单胞菌 萄球菌 1 18 17 15.5 19.5 2 18 18 16 18 3 15 15 16 18 4 10 8 -（无抗） 16 5 13 14 - 14.5 6 15 15 - 18 4.六株放线菌的初步鉴定： 4.1形态和培养特征观察： 分别接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 7 15 30d，取出插片，观察气生菌丝（包括颜色，是否产色素） 基内菌丝（包括颜色，是否产色素） 是否产生横隔 断裂等特征，并观察它们的生长情况，取成熟期的特征作为分类依据。 六株放线菌的形态特征 菌株 形体特征 菌落特征 1 气生菌丝发达，顶端弯曲钩状，基内 气丝砖红色，基丝淡黄色， 菌丝发达，多分枝，梗上着生有孢子 有淡红褐色色素产生 2 气生菌丝较少，孢子丝呈螺旋或曲 气丝浅砖红色，基丝黄色， 线状，基内菌丝发达，呈分枝状， 有淡红褐色色素产生 孢子丝发达，呈螺旋状，成簇生 气丝灰色，基丝淡褐黄色， 长，基内菌丝发达 无色素产生 4 孢子丝发达，多数断裂形成短链状 气丝浅灰色，基丝无色，无 孢子丝或单个游离的孢子，基内菌 色素产生 丝上有孢子着生 5 气生菌丝发达，孢子丝多呈直线型， 气丝灰白色，基丝淡黄色， 少数弯曲，基内菌丝发达 有黄绿色色素产生 气生菌丝发达且交织一起，孢子丝 气丝白色，基丝黄色，有 多呈直线型，基内菌丝发达，有孢 黄绿色色素产生 子着生 4.2生理生化试验： 明胶液化 牛奶凝固和胨化 硝酸盐还原 淀粉水解 硫化氢产生等试验。 六株放线菌的生理生化试验特性 明胶 牛奶 牛奶 硝酸盐 淀粉 硫化氢 菌株 液化 凝固 胨化 还原