黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞增殖与凋亡影响及机制研究.pdfVIP

中文摘要 黏着斑激酶相关非激酶对肝星状细胞增殖与凋亡 的影响及机制研究 摘 要 肝星状细胞的活化、增殖、黏附、迁移以及细胞外间质 (extracellular matrix，ECM)分泌增加是肝纤维化形成的中 心环节。HSC增殖和凋亡受多种因素、多条信号转导通路调 斗卜 1丁。 adllesion 黏着斑激酶(focal l(inase，FAK)是整合素信号 转导通路中连接整合素与下游信号分子的媒介，处于细胞内 多条信号转导通路的交汇点，能激活多条信号转导通路。 FAK被激活后可以调节其下游信号分子，引起细胞骨架组装 和某些基因表达，可以通过Ras依赖的丝裂源活化蛋白激酶 ActivatedProtein (Mitogen 反应，参与细胞铺展、迁移、增殖、分化和凋亡等多种功能 活动。 抑制因子，参与体内FAK功能的负向调节。对大多数细胞 类型来说，F脚的过量表达能抑制细胞的铺展、迁移、增 殖和生长因子介导的MAPK通路。但是F砌岖对HSC增殖 与凋亡的影响及其分子机制尚未见报道。 为此，我们应用体外细胞培养技术，在脂质体介导下将 F砌Ⅸ质粒瞬时转染HSC，研究选择性抑制Ⅳ水磷酸化对 中文摘要 影响，以及该过程中某些信号转导分子的作用。 目的：应用F砌嗽质粒瞬时转染HSC，探讨F对Ⅸ选 择性抑制FAK磷酸化对FN刺激的HSC增殖与凋亡的影响， 方法：应用含2％胎牛血清、100 IU．mLo青霉素、100 mmol·L。1谷氨酰胺及1mol·L。1船PES的 “g．mL。链霉素、4 RPMI 实验步骤操作，采用脂质体介导的方法进行FRNK质粒转染。 实验分5组：①对照组；②FN组；③脂质体组；④空质粒 组；⑤F对暇质粒组。②～⑤组中FN浓度均为50“g．mL～。 胞术(flow 电镜技术检测细胞的凋亡，采用改良的MTT法等测定细胞 增殖，采用Westemblot及RT—PCR等实验方法，检测F砌咏、 FAK、p—FAK(Tyr39 bcl．2、bax和 采用流式细胞术及RT—PCR等实验方法检坝0 caspase．3的表达情况。 结果：①F砒嗽成功转染HSC：Westemblot显示，在 125 kD位置出现ⅣⅨ杂交带，光密度值分析结果显示，FAK h、24h、48h、72 蛋白表达量于转染后O h无明显变化， 胗0．50。同时在42l(D处出现F砌恨杂交带，随转染时间延 长，FRNK表达逐渐增强，转染后48h表达最强，72h减弱， 经统计学处理有显著性差异，尸0．Ol。说明FRNK转染HSC 成功，于转染后48h其表达最强，而FAK蛋白表达在转染 前后无明显变化。②F砌暇抑制HSC增殖：在96孔板内转 中文摘要 染含FRNK的质粒，采用改良的MTT法检测后显示F对哌 h、24h、48 对HSC增殖有显著抑制作用，于12 h的增殖抑 ● ● 碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术检测细胞凋亡显示：FN ‘。1 7 (10．27 组、脂质体组和空质粒组之间[(11．48±O．88)％， ◆L ±1．89)％，(9．28±1．05)％】无显著性差异，胗O．05，此三 组与对照组(14．21±1．03)％相比，HSC凋亡受到抑