对虾白斑综合症病毒透射电镜分析中病毒固定条件的优化.pdfVIP

第32卷第2期 应用海洋学学报 V01．32．No．2 2013年5月 JournalofAppliedOceanography May，2013 对虾白斑综合症病毒透射电镜分析中 病毒固定条件的优化 邬君君，谷 力，李 钫 (国家海洋局第{海洋研究所，福建厦门361005) 摘要：电镜观察是研究对虾白斑综合症病毒(WSSV)形态和结构的重要手段．本研究采用不同浓度 的多聚甲醛和戊二醛对纯化的WSSV粒子进行固定，从中寻找最优的固定条件用于病毒的透射电 镜(TEM)分析．实验结果显示，经过多聚甲醛或者戊二醛固定的WSSV粒子对吸附、染色等实验操 作的耐受性较未固定样品有显著提高，在制样过程中没有发生明显的结构破坏．其中1．00％(V／V) 多聚甲醛常温固定20min对WSSV粒子的结构保持得最好．进一步地分析表明，1．00％多聚甲醛 固定后的病毒粒子更有利于金标免疫电镜的研究． 关键词：海洋生物学；固定；对虾白斑综合症病毒；多聚甲醛；戊二醛 DOl：10．3969／J．ISSN．2095-4972．2013．02．020 中图分类号：P735 文献标识码：B 对虾白斑综合症病毒(white vi— 型使之固定，其作用具有穿透力强、组织收缩小、固 spotsyndrome ms，WSSV)是一类双链DNA病毒．该病毒宿主范定均匀等特点。6。7J．因此本研究选择了两种醛类：多 围广、传染力强、致死率高，是目前危害对虾养殖业 聚甲醛和戊二醛，将不同浓度固定剂对WSSV的固 最主要的病原体¨。．WSSV粒子呈杆状，长约210～ 定效果进行评估，以获得最优的WSSV固定方法．实 380 nm，宽约70～167am．主要由囊膜、被膜和核衣 验表明经过固定的病毒粒子对电镜制样等操作的耐 壳3部分组成，有些病毒颗粒上具有一个尾状结 受性有所提高，可以较好地维持病毒粒子的完整性， 构‘2。3o．病毒的结构蛋白主要包括膜蛋白、被膜蛋白 为研究病毒粒子的形态结构奠定基础． 和核衣壳蛋白3个部分，这些蛋白维持着病毒的基 1材料与方法 本构象，并与病毒的侵染密切相关Hj． 在对WSSV的研究过程中，经常需要通过透射1．1 材料 clakia)购自厦门市第 电镜(TEM)对纯化的病毒粒子进行观察．通常情况 克氏原螯虾(Procambarus 下研究者是用悬滴法将纯化的病毒粒子吸附在铜网 八市场；多聚甲醛购自泰京公司；戊二醛、胶体金标 之上，经过负染色之后再进行电镜分析j．然而我 们在实验中发现这一方法的效果并不稳定，经常出 碳支持膜购自中镜科仪公司；山羊血清购自博士德 现病毒粒子破裂的状况，推测这可能是由于病毒囊 公司；鼠抗VP28单克隆抗体与小鼠免疫前血清为 膜对制样过程耐受性较差，因此采用合适的固定液 实验室自制． 对病毒进行固定后再制样有可能解决这一问题． 1．2方法 目前用于生物样品固定的试剂种类繁多，其中 1．2．1 病毒的提取与固定取濒临死亡的螯虾进 较为常用的是醇类、醛类、酸类、四氧化锇等．其中醛 行病毒的提纯，WSSV病毒粒子的纯化和浓度定量 类固定液通过形成分子问的交联，从而影响蛋白构 分析参照本实验室已建立的方法∞，8|．将纯化的病 收稿日期：2012-08-09 专项资金资助项目(海三科2009044) 作者简介：邬君君(1987～)，女，硕士研究生；E-mail：m