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生物量碳的测定方法.doc
氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳
一、采样与样品预处理
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2~3 mm),或放在低温下(2~4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛,进行晾干时,必须经常翻动土壤,避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右,在室温下于密闭装置中预培养1周,密闭容器中要放入两个50mL的烧杯,分别加入水和稀NaOH,以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析,若需要放置一段时间,在低温下(2~4℃)最好不要超过10d。
土壤田间持水量采用改进的Shaw(1958)方法测定。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管,漏斗用玻璃纤维堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中,夹紧橡胶管,加入50 ml水,保持30 min,再打开夹子使多余的水流入量筒,30 min后测定流出的水量,同时测定土壤湿度,计算土壤田间持水量,用烘干土壤质量表示。
二、方法—氯仿薰蒸浸提法(FE)
1、方法原理
土壤经氯仿薰蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后,细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。
浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定,也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。
2、仪器及设备
培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率200rev/min);冰柜;磷酸浴。
3、试剂
无乙醇氯仿:量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中,加入50mL硫酸溶液[((H2SO4)=5%],充分摇匀,弃除上层硫酸溶液,如此进行3次。再加入50 mL去离子水,同上摇匀,弃去上部的水分,如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中,并加入约20g无水K2CO3,在冰箱的冷藏室中保存备用。(试剂浓硫酸 ((H2SO4)=95~98% ,稀释19倍)
硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾(K2SO4,化学纯)87.10g,加热溶于去离子水中,稀释至1L。(需加热溶解)
重铬酸钾[c(1/6K2Cr2O7)=0.2000 mol·L-1]: 称取经130 oC烘干2~3h的重铬酸钾(K2Cr2O7,分析纯)9.8110g,溶于1000mL的去离子水中。
重铬酸钾标准溶液:[c(1/6K2Cr2O7)=0.1000 mol·L-1]: 称取经130 oC烘干2~3h的重铬酸钾(K2Cr2O7,分析纯)4.9055g,溶于1000mL的去离子水中。
邻啡罗啉指示剂:称取邻啡罗啉指示剂[C12H8N2·H2O,分析纯]1.49g,溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去离子水中,密闭保存于棕色瓶中。
硫酸亚铁溶液[c(FeSO4)=0.05 mol·L-1]:称取硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)约13.9005g,溶解于600~800mL去离子水中,加浓硫酸(化学纯)20mL,搅拌均匀,定容至1000mL,于棕色瓶中保存。此溶液不稳定,需在用时每天标定其浓度。
硫酸亚铁溶液浓度的标定:
吸取重铬酸钾标准溶液5.00mL,放入100mL三角瓶中,加水约20mL,加浓硫酸5mL和邻啡罗啉指示剂2滴,用FeSO4溶液滴定,根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。
硫酸亚铁溶液标定方法:吸取0.1000 mol L-1(1/6 K2Cr2O7)(试剂4)5.0ml,放入150ml三角瓶中,加浓硫酸5ml和邻啡罗啉指示剂2滴,用硫酸亚铁溶液滴定,滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度,即C2 =(C1 ( V1)/ V2。
式中: C1—重铬酸钾标准溶液浓度(0.1000mol L-1);
C2—硫酸亚铁标准溶液浓度(mol L-1);
V1—吸取的重铬酸钾标准溶液体积(5ml);
V2—滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积(ml)。
4、操作步骤
4.1薰蒸
称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份,分别放在约100 mL的烧杯中,一起放入同一干燥器中,干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度,同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量,同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片),用少量凡士林密封干燥器,用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门,在25oC的黑暗条件下放置24h。
打开阀门,如果没有空气流动的声音,表示干燥器漏气,应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时,取出装有水、碱液和氯仿的烧杯,氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部,用真空泵
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