第九章动物基因工程.pptVIP

8.2转基因导入细胞内的方法 8.2.1物理方法 8.2.2化学方法 8.2.3生物学方法——动物病毒转染法 8.2.1物理方法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。 （1）裸露DNA直接注射(适合于基因表达技术) 肌肉注射 、肝脏、甲状腺、心肌、脑、泌尿器官组织间隙、肿瘤内注射。虽然转染的裸DNA分子通常并不整合于染色体，但目的基因的表达也可以持续几个月，但效率不高。 （2）电穿孔（Electroporation） 　　电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。 （3）显微注射 I方法 将外源DNA分子导入受精卵的雄原核内，通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。 然后再将受精卵植入假孕的动物体内，使其生长发育。 出生的子代作DNA检测筛选出转入基因整合和表达的子代。 8.2.2 化学方法 （1）磷酸钙沉淀 将氯化钙，DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。 磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。 （2）DEAE-葡聚糖 带正电的（二乙基乙醇胺 ）DEAE-葡聚糖和带负电的DNA分子相互作用形成复合物，使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。 DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 （3）脂质体介导法 8.2.3 生物学方法——动物病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。 这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 （1）人腺病毒DNA 1.腺病毒的生物学特性 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮(nie)齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。 目前，复制缺陷性的重组腺病毒是在基因治疗临床试验领域中比较常用的病毒载体。 （5）逆转录病毒介导的基因转移 反转录病毒是单链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。 优点： 宿主范围广（几乎所有类型哺乳动物细胞） 效率高，可以感染大量的细胞，通常一次可以感染106～107细胞 外源DNA在整合时不发生重排，低拷贝整合（一般不超过5个) 缺点： 只感染分裂细胞 携带外源基因的长度有限(8kb) 载体病毒基因有潜在的致病性，如存在载体与人内源性逆转录病毒（HERV）序列间发生重组而产生有感染能力的人逆转录病毒的潜在危险 目前有十余种选择性标记可供使用。最常使用的有胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氨基葡萄糖３‘磷酸转移酶基因（neo ） 等基因。 氨基葡萄糖苷３‘磷酸转移酶（APH）能使一种氨基葡萄糖苷类扩生素——G418磷酸化而失活。 G418对哺乳动物具有高度的毒性，400ug/ml的浓渡下哺乳动物细胞就不能存活，其毒性在于干扰细胞的80S核糖体的功能而阻断细胞蛋白质的合成，许多哺乳动物细胞对G418敏感。 三、其它类型的筛选标记基因 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补； 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补。 哺乳动物受体细胞常见的选择标记基因 遗传标记 编码产物 筛选药物 作用机理 APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418 DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR变体抗氨