猪β-防御素1基因在大肠杆菌中的表达与活性鉴定.pdfVIP

摘要 摘要 防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物的防御过程中产生的一类重要的抗菌肽类 物质。它具有十分广泛的抗菌谱，可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物。由于其独 特的抗菌机制，不会诱发细菌耐药性的产生，己成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。 猪13防御素-1(porcine13-defensinl，pBD．1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝和。肾等多 种组织细胞内的一类活性多肽，在猪防御系统中起重要作用。它同样可被用作食品保鲜剂和 饲料添加剂，随着对其研究的深入，可以相信猪防御素将在动物养殖、疾病预防和提高畜产 品品质等方面发挥更大作用。本研究的目的就是在克隆猪舌上皮防御素的基础上，利用大肠 杆菌表达系统实现pBD．1的高效表达，通过蛋白复性方法，以期获得高产量有活性的防御素 产品，为猪防御素的工程化生产及在畜牧养殖业中的应用奠定基础。 列及载体pET-30a的多克隆位点为基础设计引物，其中上游引物含有BamHI酶切位点，下游 中进行序列测定。通过BamHI和Xhol限制性内切酶酶切重组质粒pMDl8-T-pBD．1获得编码 成熟肽pBD．1基因，大小为126 定，成功构建pBD．1的融合表达系统。阳性克隆菌经摇瓶发酵和IPTG诱导，菌液破碎后进 行TricineSDS．PAGE分析，融合蛋白纯化，酶切去除His标签，蛋白复性，最后利用琼脂孔 穴扩散法检测抑菌活性。结果表明，融合蛋白His．pBD．1以可溶性的形式进行表达，蛋白纯 化后经Bradford法测定lL菌液可表达约50 mg的融合蛋白；蛋白复性后，His—pBD．1和pBD—l 蛋白均表现出对链球菌良好的抑菌活性，可见His标签对pBD．1蛋白的活性没有影响，pBD．1 对链球菌的最小抑菌浓度为40-A：5．2 1ag／ml。这为进一步的细胞毒性实验、免疫原性检测和抗 菌制剂的开发等后续工作奠定了良好的基础。 以巴马小猪为对象建立链球菌感染模型，采用定量PCR方法，测定感染后不同时间点猪 h 舌上皮黏膜中pBD．1表达量。结果表明，染菌后3pBD．1的表达水平显著提高(p0．001)， 且在6h达到最高水平，染菌后12h其表达水平恢复正常。链球菌刺激对猪舌上皮黏膜中 pBD．1的表达有增量调节作用。 关键词猪p-防御素1；融合表达；抑菌活性：链球菌 Abstract andIdentificationof Porcine 1 Expression 13-defensin inE．coli Abstract Defensinswasan antimicrobial the the important peptidesgeneratedby organismduring defensereaction．It possessed like broad—spectrumantimicrobial，including manymicroorganisms viruses．Antibacterialdidn’tinducetheresistance bacteria,fungi，envelopedpeptides ofbacteria becauseofits