马铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导病毒抗性影响.pdfVIP

尔农业人学I博lj学位沦文 中文摘要 RNA沉默是牛物抵御外来核酸入侵以保持牛物自身基因组完整性的一种高度保守 的、序列特异的RNA降解机制，广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核牛物中。 Virus RNA介导的病毒抗性(RNA．Mediated 一种新的抗病毒基因工程策略，它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的转录后基因沉 默，具有抗病程度高、抗性持久及牛物安全性高等优点。在前期的研究中，人们发现并 virus effects)所致。本研究首先以马铃薯Y病毒(PotatoY，PVY)外壳蛋白基因(CP) 的比较PWCP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响。在此基础上，以水稻黑 streaked black 条矮缩病毒(Rice 的序列为靶序列，构建hpRNAi植物表达载体，转化水稻，进一步比较了不同位置的靶 序列对RNA介导的病毒抗性的影响，筛选获得了高抗RBSDV的转基因水稻新材料。 研究结果对有效地选择靶位点序列和高效地应用RMVR策略培育抗病毒转基因植物具 有重大指导意义。研究结果和丰要结论如下： 1．马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响 将PVYN 结构的植物表达载体pROK．CPs(pROK．CPI～pROK．CP8)。 将构建好的16个重组植物表达载体(3’端的8个载体由姜芳构建)利用冻融法导入 农杆菌EHAl05，并瞬时侵染本牛烟以验证其有效性。Northernblot结果显示，16个植 基因PVYCP的表达进行有效地下调。 采用冻融法将构建成功的植物表达载体导入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草 置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，选取抗性幼苗进行温室移栽并进行PCR检 72株TI代转基冈植株。 以PvYN的病毒汁液为接种物，摩擦接种16个载体的转基因烟草(3’端的8个载体 ，5铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基Iq不I司区段对hpRNA介导的病毒抗t5-影响 的转基冈烟草由姜芳转化获得)，通过症状观察及ELISA检测进行抗病性分析发现，转 5％、6．27％、 pROK．CP5～pROK—CPl6的转基因株系中抗性植株的比例分别为27．1 结果表明，以CP基因37端为靶序列比以5’端为靶序列更能有效地介导对PVY的抗性。 blot杂交分析表明，转基因都在RNA水平上得到了表 Tl代转基因植株的Northern 达，抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株，即抗性与RNA积累量呈负 相关，同时，在所有转基因植株中均能检测到siRNA，表明植株对病毒的抗性是由RNA 所介导的，但植株的抗病性与siRNA积累量之间没有明显的相关性。 T2代植株中稳定遗传。 2．水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对hpRNA介导的病毒抗性影响 CP 利用PCR技术扩增来自RBSDV 和RBSDV-CP3t，酶切鉴定表明植物表达载体构建成功。 将构建好的三个重组表达载体利用冻融法导入农杆菌EHAl05中，采用农杆菌介导 草剂和PCR检测，分别获得19、2l和22株To代转基因阳性植株。 将To代自交结实后获得的Tl代转基因植株，利用叶片涂抹PPT的方法，筛选TI 代阳性转基因植株。每个株系各选取50株阳性植株，用来自山东济宁的带毒灰飞虱接 表明靶向于RBSDVCP3’端的hpRNA可介导更高的抗病性。 类型的感病植株，并且转基因植株中有siRNA存在，这表明病毒抗性是由RNA介导的。 但同时还发现siRNA积累量与植物抗性之间没有明显的相关性。 关键词：外壳蛋白基因；位置效应；马铃薯Y病毒；水稻黑条矮缩病毒：RNA介导的 病毒抗性 Ⅱ ofPVY SpecialOrigin andRBSDVCPInfluence