口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定_临床医学论文.docVIP

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定_临床医学论文 口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定_临床医学论文 作者：田美娜, 李永亮 卢曾军, 付元芳, 袁明, 刘湘涛, 刘在新 【摘要】 目的: 制备并鉴定口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法: 以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100％的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果: 免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论: 成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。 【关键词】 口蹄疫病毒; 非结构蛋白3D; 单克隆抗体; 原核表达 口蹄疫(foot是由口蹄疫病毒(foot引起的偶蹄动物的急性、 热性、 高度接触性传染病, 世界动物卫生组织将其列为A类传染病之首, 该病一经暴发就会给畜牧业生产造成巨大的经济损失, 严重影响了政治、 经济的稳定发展, 世界各国都高度重视对该病的防控, 完善的诊断和检测技术体系是控制和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗体的ELISA方法不受血清型限制, 因此在疫情普查、 筛查感染动物、 防制效果评价和恢复无FMD状态等方面具有重要的应用。 FMDV的3D蛋白是具有469个氨基酸的病毒RNA依赖的RNA聚合酶, 又称病毒感染相关性抗原, 没有型特异性, 在FMDV所有非结构蛋白中, 3D抗原性最好, 检测3D的ELISA方法具有与检测结构蛋白的ELISA方法相当的特异性、 准确性和敏感性, 是评价动物是否接触过抗原的重要指标, 在检测中具有重要的应用前景［1-4］。 本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体（mAb）, 为建立更为完善的ELISA诊断方法和检测技术以及进一步研究3D蛋白的结构和功能提供基础资料。 1 材料和方法 1.1 材料 O/China99口蹄疫病毒、 BHK细胞株、 牛抗FMDV高免血清均为本实验室保存, Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院惠赠, 3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠, SPF级雌性3～4周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所, 福氏佐剂、 聚乙二醇(PEG)1450溶液、 HAT、 HT 以及四甲基联苯胺(TMB)、 HRP 标记羊抗小鼠总IgG、 mAb亚型鉴定试剂盒均为Sigma 产品; RPMI1640 培养基、 新生牛血为Hyclone公司产品, FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司, HI Trap rProtein G FF, 1 m蛋白纯化柱为Amersham公司产品, Ni购于Invitrogen公司, 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组pET28a蛋白的表达、 纯化及活性鉴定 按文献［5］所述方法表达3D蛋白, 将可溶性表达的3D蛋白按Ni操作说明书进行纯化, 用SDS电泳鉴定纯化产物的纯度, 用Western blot鉴定其特异性。Western blot方法参照文献［6］进行: 以牛抗FMDV高免血清为一抗, Sigma公司辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗, DAB染色。 1.2.2 3D mAb的制备 （1）小鼠免疫: 取纯化的抗原按100 μg/只加等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射, 2周后用弗氏不完全佐剂第2次免疫, 剂量、 注射部位同前, 2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内侧皮下注射, 1周后采尾静脉血测抗体效价, 取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉加强免疫1次, 在此之后第3天融合。（2）阳性杂交瘤细胞株的建立: 采用常规的PEG融合的方法取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a蛋白包被聚苯乙烯板, 取融合后第10～15天的细胞培养上清进行间接ELISA检测, 选择检测结果为强阳性的克隆扩大培养, 同时用有限稀释法至少连续克隆3～5次, 直至所克隆的细胞能够100%分泌抗体。将能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩增培养后, 冻存于液氮中。 1.2.3 腹水的制备 将0.5 mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔, 1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔, 7～10 d后, 当小鼠腹部