圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响_临床医学论文.docVIP

圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响_临床医学论文 圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响_临床医学论文 作者：田素燕 李连之 高 磊 穆建帅 刘晓燕 谭相石 【摘要】 采用远紫外圆二色光谱法系统地研究了细胞红蛋白(cytoglobin, Cygb)的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对细胞红蛋白二级结构的影响。结果表明: 当Cygb浓度lt;1 μmol/L时，它主要以α螺旋形式存在，其α螺旋含量gt;60%; 当Cygb浓度从0.3 μmol/L增大到2.0 μmol/L时，其α螺旋含量迅速降低;当Cygb浓度gt;2.0 μmol/L时，其α螺旋含量随浓度的增大变化很小(约30%)。随着温度的升高，Cygb的α螺旋含量逐渐减小，但既使温度达到368 K，它仍保持有20%的α螺旋结构，说明该蛋白具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中，Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中，Cygb的α螺旋含量明显增加，这说明醇类可以诱导其α螺旋的生成。 【关键词】 细胞红蛋白, 圆二色光谱, 二级结构, α螺旋 　1 引 言 　　细胞红蛋白(cytoglobin, Cygb)是近期在脊椎动物组织中发现的第4种珠蛋白[1]，它具有典型珠蛋白的“three类型的α螺旋三明治折叠结构，但E螺旋中的His81却与血红素配位，形成与神经红蛋白(neuroglobin, Ngb)相似的六配位的血红素[2,3]。Cygb在人体各类组织中几乎都有表达，但其确切的生物功能目前还不完全清楚。研究表明，Cygb可能具有携氧、储氧、氧感受器以及过氧化物酶等功能，此外它也可能与胶原形成有关[4]。 　　目前，在Cygb的空间结构、携氧动力学特征和功能多样性等方面都有了一定的研究[1,4～7]，但对Cygb在溶液中的结构特性以及各种环境因素对其结构和构象的影响的研究甚少。研究蛋白质在溶液中的结构状态及结构变化对于了解其功能至关重要，圆二色光谱(CD)是研究溶液中蛋白质二级结构的一种强有力的实验方法[8～10]。本研究以远紫外圆二色光谱技术研究了细胞红蛋白的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对Cygb二级结构的影响，深入了解Cygb化学生物学的基本性质，为研究Cygb的生物功能及其在医药学的的应用提供有用的信息。 2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　AKTA purifier 100快速蛋白纯化系统(瑞典Amersham Biosciences公司); J圆二色光谱仪(日本Jasco公司); HP8453 型紫外可见阵列二极管分光光度计(美国Hewlett公司)，pHS计(上海雷磁公司)。 　　带有人细胞红蛋白基因的pET3a质粒由德国 Johannes Gutenberg University of Mainz大学 Frank Gerlach 教授提供。E.Coli BL21(DE3)plys为本实验室保存，酵母提取物和胰化蛋白胨(英国Oxoid公司)，实验用水为二次去离子水，其它试剂均为国产分析纯或生化试剂。 　　2.2 细胞红蛋白样品的制备 　　将带有细胞红蛋白基因的pET3a 质粒转入E.Coli BL21(DE3)plys 细菌中，按文献[11]方法进行发酵表达，收集菌体。此蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达，本研究以更接近天然态的可溶性形式表达的蛋白为研究对象。可溶性形式表达的蛋白依次经(NH4)2SO4分级沉淀，Q Sepharose F F阴离子交换柱，Hiload16/60 Superdex 75 凝胶过滤柱和CM Sepharose F F 阳离子交换柱纯化，得到电泳纯的细胞红蛋白。细胞红蛋白贮存液的浓度通过测定其在280 nm处的吸光度值(ε280=27.8 L/(mmol·cm)) 计算[12]得到。 　　2.3 圆二色光谱的测定 　　在5 mmol/L TrisHCl(pH 7.4)缓冲溶液中，蛋白终浓度依次为0.3, 0.9, 1.5, 2.0, 3.1, 3.9, 4.8, 5.3, 9.6和19.4 μmol/L时考察蛋白浓度对Cygb的CD谱的影响。在10 mmol/L Tris缓冲溶液中，蛋白终浓度为1.5 μmol/L，每个测量温度(298.0～368.0 K)温育10 min，考察温度对Cygb的CD谱的影响。在10 mmol/L Tris 碱贮存液中，加HCl或NaOH溶液调节其pH值至所需范围(2.2～12.0)，用pHS计测量pH值，蛋白终浓度为4.5 μmol/L， 4 ℃放置12 h，考察不同pH溶液对Cygb的CD谱的影响。溶剂分别为水、100%甲醇、70%乙醇，蛋白终浓度为4.8 μmol/L， 4 ℃放置12 h，考察溶剂性质对Cygb的CD谱的影响