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大肠癌组织中VEGF-C、VEGFR-3、LMVD与临床病理参数的关系_临床医学论文 大肠癌组织中VEGF-C、VEGFR-3、LMVD与临床病理参数的关系_临床医学论文 作者：李克强 李光明 曹树立 刘颖斌 胡锡浩 【关键词】 大肠癌组织　VEGF-C　VEGFR-3　LMVD 　　淋巴道转移是大肠癌的主要转移途径，淋巴道转移时必须流经新生的淋巴管，但淋巴管生成的机制尚不清楚。本研究通过免疫组化技术检测淋巴管生成因子（VEGF-C）及其受体（VEGFR-3）,通过5，-核苷酸酶(5，-Nase)组织化学技术检测淋巴管密度(LMVD)，探讨淋巴管生成因子及LMVD与临床病理参数的关系，在淋巴管生成的分子生物学及形态学方面探讨大肠癌的淋巴管生成与淋巴转移机制，为大肠癌的临床分期、预后判断及抗淋巴转移提供理论依据及技术支持。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　收集(同济大学附属同济医院)2001年12月至2003年10月手术切除的大肠癌新鲜标本50例，患者术前均未接受放、化疗，术后经病理检查确诊。每例大肠标本取大肠癌组织、癌旁组织、正常肠组织各一块，所有标本在肿瘤切下后1h内置于液氮中，然后置于-70℃低温冰箱保存备用。50例中男22例，女28例，年龄23～90岁(平均69.52岁)；腺癌45例，黏液腺癌5例；高分化(G1)18例，中分化(G2)22例，低分化(G3)10例。同时收集50例大肠癌患者的Dukes分期、组织学类型、分化程度、淋巴结转移等病理资料。 　　1.2 免疫组织化学染色与定量分析 　　采用免疫组化SP法检测对50例大肠癌组织、正常肠组织测定VEGF-C、VEGFR-3表达情况，VEGF-C、VEGFR-3试剂盒均购自晶美生物工程有限公司（SABC方法）。一抗稀释浓度均为1：100，以已知阳性切片为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，免疫组化流程参照说明书进行。染色结果判断：VEGF-C、VEGFR-3表达于肿瘤细胞浆，阳性细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒染色，以阳性细胞超过全部肿瘤细胞的10%为表达阳性。定量分析:采用Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统(ZEISS，德国)对免疫组织化学染色进行定量分析［１］。图像分析的基本步骤：（1）图像输入:真彩色彩图,画面1300×1030 ；（2）图像增强:去除原图中各种噪声和畸变,使像质得到改善，常用阴影校正、对比度增强、灰度变换、平滑处理、锐化处理等法；（3）图像分割:根据图像的结构特征,选取灰度阈值,分离出感兴趣的对象物, 变为黑白二值图像；（4）图像二值化处理: 对二值图像进行处理，整理图像画面,保留待测对象，常用腐蚀膨胀、填空洞、擦碎片等方法；（5）图像识别及图像分析处理:选取测量参数,自动测量和分析，数据可转换到Excel进一步分析处理；（6）每张切片随机采集3幅图片进行测量，取平均值。以同样方法检测对照组标本。 　　1.3 酶组织化学染色 　　5，-核苷酸酶（5，-Nase）淋巴管染色：（1）丙酮固定5min；（2）孵育：将冰冻切片放入盛有5，-Nase孵育液容器内，37℃孵育箱孵育30min；（3）染色：蒸馏水洗切片，1％硫化亚氨显色1～2min;(4)透明、封片。 　　1.4 图片分析法定量 　　5，-Nase淋巴管染色定量分析已染色好的切片置于Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统检测LMVD，将酶组织染色好的切片置于Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统的图像分析仪200倍视野下，以淋巴管为测试对象，随机选择5个视野计数LMVD，5个均值为该组织的LMVD。结果判定：淋巴管呈棕色，在同一切片上较易判断，同一组织做HE染色对照观察。 　　1.5 统计学处理 　　所有数据均使用SPSS 11.5软件包进行统计处理。VEGF-C、VEGF-D和淋巴管密度与临床病理因素的关系、各组及组间比较采用χ2检验、t检验或方差检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 两组VEGF-C、VEGFR-3、LMVD比较 　　见表1。实验组VEGF-C(图1)、VEGFR-3(图2)阳性率及LMVD(图3)均高于对照组，提示大肠癌组织中淋巴管生成增加(表1)。表1 大肠癌、正常组织中VEGF-C、VEGFR–3、LMVD的表达（略） 　　2.2 实验组VEGF-C、VEGFR-3与LMVD的关系 　　实验组VEGF-C、VEGFR-3的表达与LMVD存在相关性，VEGF-C阳性组中的LMVD高于阴性组（11.86±2.42与7.82±2.69, P＜0.01），见表2; VEGFR-3阳性组中的LMVD高于阴性组（11.84±2.38与8.54±3.15, P＜0.01），见表3,说明VE