宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨_临床医学论文.docVIP

宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨_临床医学论文 宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨_临床医学论文 作者：马彦， 王振海， 孔繁元， 谢鹏 【摘要】 目的 了解宁夏地区黄牛博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)的自然感染情况，对检测到的BDV p24基因阳性扩增片段进行核苷酸序列比对，探讨其与国际标准病毒株及其分离株的同源性。方法 采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区205例健康牛外周血单个核细胞(PBMCs)BDVp24基因片段，并对其中的阳性扩增产物进行基因序列测定，然后应用BLAST软件以及DNAsist 5.0 软件对测序结果分析。结果 205例中3例阳性，阳性率为1.5%;该BDVp24 片段的核苷酸序列与Strain H3915 同源性最高达97.67%，与标准病毒株 H1766同源性为96.51%，与Strain V/FR的同源性为95.35%，且它们编码的氨基酸相同。结论 宁夏地区黄牛中存在动物源性BDV的自然感染，该BDV p24核苷酸序列与标准病毒株具有高度同源性。 【关键词】 博尔纳病病毒;荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应;牛外周血;宁夏 博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是非细胞溶解性的、负链、单股的RNA 嗜神经病毒。研究表明，BDV具有广泛感染宿主，可感染鸡、山羊、兔、驴、骆驼、羊驼、牛、狗、猫、驼鸟以及人等在内的几乎所有温血动物，并引发Borna 病(Borna disease，BD)，临床表现为致死性中枢神经系统损害，以行为异常、脑实质和脑膜的炎性细胞浸润，以及疾病特异性抗原在边缘系统中积聚为特征。目前尚未见中国牛感染BDV的文献报道，特对宁夏地区黄牛进行了BDV感染的检测，现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 205例健康成年黄牛均来自宁夏地区，每例取外周乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血5mL。 　　1.2 方法 试剂和其它材料包括：Ficoll-conray液，Trizol RNA提取抽提剂(购自BioFlux)，BDV p24荧光定量PCR检测试剂盒(购自广州达晖生物技术有限公司)。BDV p24基因扩增产物及探针序列：外引物P1为5’-TGACCCAAACCAGTAGACCA-3’(19bp)，P2为5’-GTCCCATTCATCCGTTGTC-3’(19bp);内引物P1为5’-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3’(19bp)，P2为5’-CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3’(22bp);荧光探针为5’-FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3’(25bp)。BDV重组质粒由重庆医科大学神经病学研究所提供。采集EDTA抗凝外周血各5mL，分别用Ficoll-conray液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，标本置-80℃保存备用。然后进行(1)RNA完整性检测：采用1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5%)电泳。取RNA样品5μL加样，以3～4 V/cm电压电泳25min，在凝胶扫描系统中观察结果并照相。(2)BDV质粒标准曲线制作：将重组质粒定量后作为阳性模板，稀释至107 、106、105、104、103 、102 拷贝·μL-1浓度梯度，于Roter-gene 6000型扩增检测仪上进行PCR扩增，由电脑自动分析出定量结果，并给出PCR扩增的动力学曲线。(3)FQ-nRT-PCR检测BDV p24基因片段(按照BDVp24荧光定量PCR检测试剂盒说明进行)：首先进行逆转录反应，在含RNA的Ep管中加入7μL逆转录体系反应液Ⅰ，逆转录酶1μL，DEPC水7μL，总反应体积为20μL，于37℃ 持续1h;然后取逆转录产物5μL，加入反应液Ⅱ8μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水11μL，反应体积为25μL，进行PCR第一步扩增：93℃4min预变性，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1min，循环20个周期;再取PCR第一步扩增产物5μL，加入反应液Ⅲ 14μL，TaqDNA聚合酶 1μL，去离子水30μL，反应体积为50μL，进行PCR第二步扩增：93℃3min预变性，93℃变性45 s，55℃延伸60 s，共循环40个周期。每次实验均设阴性对照。(4)PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：将BDV p24基因片段阳性PCR第二步扩增产物5μL加样，以2%琼脂糖110V电压60mA电流电泳35min，在凝胶成像系统中扫描并照相。可见与目的基因片段相同分子量大小86bp电泳条带。将BDV p24基因片段阳性的扩增产物送上海英骏生物技术有限公