第三章细胞生物学研究方法06506.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 （三） 扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM) 三、扫描隧道显微镜 (scanning tuneling microscopy,STM) 原理： 利用量子力学的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品表面时，针尖和样品间产生隧道效应，并且隧道电流（I）和针尖与样品之间的间距（d）呈指数关系，这样由I可知d，即针尖的位置可以确定，由此样品的表面形貌也可确定。 二、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 2.Northern 印迹杂交法 （基本过程类似于Southern法） 提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA 利用植物细胞具有的全能性。 单倍体细胞培养 原生质体培养 模式生物的共同特征： a.个体小； b. 易培养； c.操作简单； d.生长繁殖快。 思考题 1. 什么是光学显微镜的分辨率？ 2. 简述光学显微镜与电子显微镜的差别。 3. 概念：原代细胞与传代细胞；细胞系；有限细胞系与永生细胞系；细胞克隆；细胞株 显微操作仪 2. 显微操作技术：在显微镜下，用显微操作仪对细胞进行解剖和微量注射的技术。 正在进行核移植操作 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 一、细胞的分离与纯化 动植物组织 单细胞悬液 混合细胞群体 单一类型的细胞或 细胞器 酶解 沉降、离心或抗原抗体结合特性 流式细胞 分选仪 组织匀浆 分离出各组分 差速离心 密度梯度离心 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 三、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法 为了测定细胞组分，利用一些显色剂与被检测物质中一些特殊基团特异性结合，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 DNA：Feulgen反应，酸解去除RNA及DNA上的嘌呤，暴露出DNA上的醛基，与Schiff试剂反应呈紫红色。 RNA：Brachet反应，可被派洛宁染成红色。 多糖：PAS反应，过碘酸将多糖氧化成高分子醛化合物，与Schiff试剂反应呈紫红色。 脂肪：四氧化锇反应，呈黑色；苏丹Ⅲ（深红色）、苏丹黑。 蛋白质：米伦（Millon）反应，呈粉红色或砖红色；重氮反应。 酶：与底物共同温育，形成电子密度的沉淀物。 四、特异蛋白抗原的定位与定性 （一） 免疫荧光技术 抗原：能刺激机体产生抗体的物质。 抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。 多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。 免疫荧光技术： 将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架 （二） 免疫电镜技术 将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。 免疫胶体金技术：将抗体与金颗粒偶联，经免疫染色后，在电镜下金颗粒所在部位即为抗原位置。 甲肝病毒 TZ84株免疫电镜照片 蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白区带 转移 硝酸纤维素滤膜 与抗蛋白抗原的第一抗体反应 与辣根过氧化酶相连的抗第一抗体的第二抗体孵育 与底物二氨基苯胺 (DAB) 反应 相应条带处着色 证明有该蛋白抗原的存在 （三） 免疫印迹技术  可从混合蛋白质中检测特定的蛋白质是否存在。 该技术灵敏，可检测微量的特定蛋白质。 方法： 未标记的一抗与目的蛋白结合； 洗膜去除未结合的一抗后，加标记的二抗孵育； 二抗与一抗结合，洗膜去除未结合的二抗； 最后加底物，二抗偶联的标记物催化底物反应产生可检测信号。 五、细胞内特异核酸序列的定位与定性 （一） 原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法，称为原位杂交。 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 （二） Southern印迹技术 是体外分析特异