有机波谱学作业.docVIP

极地微生物胞外多糖的分离纯化及结构分析 摘要 极地微生物的胞外多糖离心去沉淀，乙醇沉淀上清液，Sevag法脱蛋白，透析， DEAE-SephadexA-50柱纯化得胞外多糖EPS-2。HPLC分析证实其为均一组分，数均分子量Mn为44 461，重均分子量Mw为66 572。TLC和GC/MS分析表明，EPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖组成，摩尔比为1.00︰14.02︰0.74︰2.62︰30.06︰17.72，元素分析表明EPS-2为含硫的氨基糖。IR， 1HNMR 及13CNMR分析表明EPS-2的糖苷键为α-构型，己糖为吡喃型 ，C-2,C-3,C-4中某一碳上发生取代， C-6未发生取代。 关键词 极地微生物；多糖；结构分析( 极地、深海特殊的地理环境和气候特征造就了独特的微生物生态系统，特别是广泛存在于极区的海冰更是一个特殊的生存环境，生存于其中的微生物不仅要耐受常年的低温，而且在海冰反复冻融的过程中还要经受盐度的急剧变化。微生物在极地、深海极地条件下生存，在各种代谢水平和分子水平上的适应机制，造就了其物种、代谢产物和基因资源的独特性、多样性和新颖性，所蕴涵的应用潜力不可估量，如上所述是各国竞相争夺和研究开发的战略资源。 极地微生物可产生大量的胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，在其生境适应性中发挥着重要的作用。与中温微生物相比，极地微生物产生的EPS结构具有独特性，亲缘关系接近的极地微生物，产生的EPS的组成与结构也不同，这说明极地微生物EPS具有潜在的可供开发利用的生物活性。结构独特EPS具有多方面的免疫调节功能，可开发出治疗病毒性感染、增强机体免疫力的药品。本课题组已从南极海冰细菌Pseudoaltermonas sp.S-15-13产生的EPS中，分离纯化得到EPS-Ⅱ，解析了其结构，初步证明该多糖具有很强的免疫活性和抗肿瘤作用。 1 实验部分 1.1　试剂与仪器 DEAE-SephadexA-50凝胶（Pharmacia 产品）；阿拉伯糖（sigma产品）；其它试剂均为国产分析纯。 UV-2102 PC型紫外可见分光光度计；Waters高压液相色谱仪；Vario EL Ⅲ元素分析仪；日本岛津GCMS2010型气相色谱-质谱联用仪；Nicolet 20SX红外光谱仪；Bruker AVANCE-600超导核磁共振仪。 胞外多糖的分离纯化 极地微生物原始菌液50 ml,使用GS-15R离心机在12000转下离心15minSevag法去蛋白[3]，去有机溶剂，冷冻干燥得粗多糖。粗多糖溶于水，透析48h，离心，上清液上DEAE-SephadexA-50柱，依次用H2O, 0.1mol.L-1NaCl, 0.2 mol.L-1 NaCl, 0.3 mol.L-1 NaCl洗脱，分别收集高峰部分，经透析，浓缩，冷冻干燥后得一种主要多糖：EPS-2。 1.3　纯度鉴定 碘-碘化钾反应 在EPS-2溶液（1mg.mL-1）中加入碘-碘化钾试剂，观察颜色变化。以蒸馏水为阴性对照，淀粉溶液（1 mg.mL-1）为阳性对照。 双缩脲反应 在EPS-2（1 mg.mL-1）溶液中加入双缩脲试剂，静置20min，观察颜色变化。以蒸馏水为阴性对照，牛血清白蛋白溶液(250μg.mL-1) 为阳性对照。 Molisch反应 取EPS-2溶液各1mL，加入α-萘酚2滴，混均，沿管壁慢慢加入浓硫酸各1mL，观察交界面颜色变化。 1.3.4紫外分析 EPS-2（100μg.mL-1）在200nm-400nm处进行紫外扫描。 1.3.5高压液相色谱 样品EPS-2经HPLC分离，流动相为0.1 mol.mL-1 NaNO3 溶液，流速0 .5mL.min-1 ，根据峰型判断样品纯度。 1.4 分子量测定 采用HPLC法，样品EPS-2及标准多糖DextranT系列分别经HPLC分离，其它条件同HPLC纯度鉴定，以DextranT系列标准品的分子量对数与对应的洗脱时间作标准曲线，再根据LPS-1的保留时间求其分子量。 1.5 糖含量测定 采用改良的苯酚-硫酸法[4]，以葡萄糖为标准，在490nm处测定。 1.6糖组成分析 [5，7] 1.6.1 薄层层析 EPS-2样品10mg溶于1 mol.mL-1的H2SO4中，抽真空，封口，100℃水解8h，冷却，Ba(OH)2中和，离心，上清液浓缩。水解样品及标准单糖(半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖及甘露糖)点样于GF254硅胶板上，展开剂为正丁醇-吡啶-水（6：4：3），用α-萘酚-硫酸试剂显色。 1.6.2 GC/MS分析 EPS-2同上水解，冷冻干燥后的样品置于五氧化二磷干燥器中过夜，加入10mg盐酸羟胺