血小板衍化生长因子-BB(PDGF-BB)对体外培养的肌腱细胞增殖量效及时间关系探讨.pdfVIP

血小板衍化生长因子一BB(PDGF—BB)对 体外培养的肌腱细胞增殖量效及时间关系探讨 南京大学医学院附属鼓楼医院 梁红伟谭谦昊杰郑东风周宏初陈 曦许澎王淑琴张骏葛华强 【摘要】目的探讨小闷浓度的血小扳舒j化，{i长闪r一髓(PDGF一船)对体外培养肌腱细胞增赡的作用影响，并初步估计促 PDGF—BB作J}】12～48h促增玳能力逐渐捉幽，48h达到如 浓度在lOo-250ng／ⅡILJe健增吼能力彳f所降低(户0．05)，妇I入20ng／ml 是促肌腱细胞增矾|吱1t浓度。 【火罐i．d】血小板衍化乍KW一髓(PDG卜BB)：肌腱细胞：增雅 大量研究表明肌腱细胞是一种分化程度很高的细胞，体外培养细胞生长相对缓慢，多次传代后明显老 化…，而研究表明PI)GF—BB具有多种生物功能，是肌腱细胞增殖的有效刺激剂，能刺激DNA和细胞外基质的 合成．加快体外培养的肌腱细胞的增殖。它对细胞的刺激是以剂量依赖的方式幢1，但其最适合的剂量尚不 清楚。本实验就这一问题进行研究，将不同剂量的血小板衍化生长因子作用于肌腱细胞，进一步验证其对 细胞增殖的影响并探讨其量效关系j初步估计促增殖的最佳浓度。为以后进一步研究提供条件。 材料与方法 l 材料清洁级SD大鼠由鼓楼医院实验动物中心提供。血小板衍化生长因子一BB；I型胶原酶；0．25％胰 蛋白酶；胎牛血清；抗大鼠I、III型胶原抗体；SABc免疫组化检测试剂盒；F—12培养基、VitC。 2方法 2．1 肌腱细胞的分离和培养：按Henderson分步酶消化法分离、培养大鼠肌腱细胞。无菌条件下，横行 切取鼠双后肢屈趾深肌腱，立即放入含双抗的Hank’s液中．在无菌工作台取出肌腱。首先在放大镜下去 除肌腱外膜组织。Hank’s液洗涤三次，用0．25％胰蛋白酶及0．1％胶原酶将整段肌腱在37℃水浴箱中消 目滤网过滤去碎块，滤液以1500r／min离心5min，去上清液。下层液用培养基洗脱一次．加培养液．制成 细胞悬液。按细胞计数5×105个／m1接种于25m1培养瓶中培养。培养液由F．12培养基加10％胎牛血清， 温，5％C伤浓度，饱和湿度。 2．2肌腱细胞的定性分析 肌腱细胞长满培养瓶后，用0．25％胰蛋白酶消化，按细胞数约为2×10’个／ml 接种在6孔培养板内(内均置一清洁盖玻片)．当细胞长满培养板8096左右时取出爬有细胞的盖玻片，PBS液 洗2min×3次。用SABc免疫组化检测试剂盒及抗大鼠I、111型胶原抗体染色并照相保存。肌腱细胞的鉴定 采用免疫细胞化学染色，I型胶原染色阳性而III型胶原反应阴性者为肌腱细胞。 2．3不同浓度PDGF吨B组oD值检测大鼠肌哒细胞长满25m1培养瓶时．用o．25％胰蛋白酶消化后，用含1096 ul，共加10组， 的胎牛血清的培养液配成浓度为4×104个／ml细胞悬液．分别加入96孔板t{l，每孔加入loo 每组6孔。培养24小时细胞贴壁，更换不含血清的培养液，继续培养48小时相对同步化后，弃培养液，第 微镜下观察细胞形态及生长状况。于刺激结束前4小时每孔加入甲基噻唑基四唑(MTT)溶液(5mg／m1) 20 Il 1二甲基亚砜(DMsO)， ml。37℃继续孵育4小时，终止培养．小心吸除孔内的上清培养液，每孔加入200 震荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定每孔0D值，记录结果。 2．4PDGF一髓对肌腱细胞增殖的时间效应选择促进肌腱细胞增殖作用最佳的PDGF一阴浓度，分别于加 378 PDGF一8B后12、24、36、48、60、72小时，用MTT法测0D值，井记录结果，绘制PD6F一船对肌腱细胞 增殖的时间效应图。 2 5统计学处理实验结果均用sPss2130统计软件包进行统计分析。测定每组肌腱细胞光吸收值，并用 用均数+标准差(J±5)表示．多样本均数比较采用t检验。以P005为差异有统计学意义。 3结果 1l肌腱细胞的定性分析结果显示肌腱细胞I型腔原染色呈阳性反应(图1)．Ⅲ型艟原染色呈阴性反 应(图2)，证明培养的细胞为大鼠肌腱细胞。 幽1