毛细管电泳研究药物、蛋白和RNA的相互作用.pdfVIP

毛细管电泳研究药物、蛋白与RNA的相互作用 齐小花丁里张新祥‘常文保 (北京大学化学与分子工程学院。北京，100871) 林伟 杨铭 (北京大学医学部药学院，北京，100083) 摘要：药物毛细管电泳分析由于其独特的优势近年来发展迅速．本文利用毛细管 区带电泳法对药物，蛋白与RNA竞争作用中的反应物与产物进行分离，研究了药 物与RNA的相互作用，并进一步测定了该反应的结合常数． 关键词：毛细管电泳；药物；蛋白；RNA；结合常数 艾滋病为人类免疫缺陷病毒(HIV)所引起。HIV侵犯人体的辅助性T淋巴细胞等，使人 丧失免疫力，不能抵御各种感染病毒的侵袭，最终死亡．抑制HIV病毒。阻止病毒复制，抑 制其转录酶的药物是目前主要的研究任务。为了抑制转录的进行，现在已研究出一类药物M， 它可以与HIV-1 活应答区)的特异部位结合，从而抑制转录的激活而使转录不能进行。 为了证明药物的药效。即药物M是否与TARKNA结合以及它与转录反式激活子的竞争反 应程度，我们建立了一种利用毛细管区带电泳对药物M、H1V-IT醣和TARRNA的竞争作用中 RNA结合常数，比较两个反 的反应物和生成物进行分离，分别测定药物M、HIV-ITat和TAR 应的结合常数，就可以了解M与Tat RNA Pepfide的竞争作用。通过测定一系列药物与TAR 的竞争作用，比较KM与Kf，就可以对这一系列药物进行药效的评价和筛选。 1实验条件 1．1试剂与仪器 药物M(MW：324，由北京大学医学部提供)，蛋白(Tat RNA Peptide，MW：2297)．TAR (trans-activatorof ttameription 泳仪(北京大学)。 1．2分离条件的优化 p 缓冲液：50 8．0)，毛细管：直径75m，实际长度 mmol／L的NaH2P04-Na2HP04(pH 55 cm，有效长度47cm。温度25C．压力进样12KV。进样时间los，检测波长214m。 2结果与讨论 2．1药物、蛋白与RNA的作用 由于蛋白与RNA的特异作用，药物是以蛋白为模板来设计的。理论上药物与RNA的相互 作用情况应与蛋白RNA的相互作用情况相似，并能与蛋白相竞争以达到抑制转录的激活。从 图中可以看出．与游离时韵峰面积相比，药物、蛋白与RNA混合后各自的峰面积均明显减小， 说明与蛋白与RNA的结合类似，药物与P,NA也发生了结合作用． 2．2定量分析 以游离药物的峰面积对药物的浓度进行线性回归，得到了药物的标准曲线： 4=5870．253c一2502．661R=O．99336(』代表峰面积，c代表浓度) 同理得到蛋白的线性关系： 』=4722．275c一313．694R=O．95892(』代表峰面积，C代表浓度) 由以上线性关系可得到药物与RNA的结合常数及蛋白与RNA的结合常数： R+M=删(假设RNA与药物的结合比为l：1) ·2．76×10‘ 寐+P=PRl(假设RNA与蛋白的结合比为X：1) X10’ (x=1) 在蛋白与RNA的二元体系中：KP=1．03 芒】 《 0 4 日 12lfi 20 t(min) 图1药物蛋白与RNA相互作用的毛细管电泳图 a：纯RNA(1．07x104mol／L)， c：药物