葡萄种质超低温保存后遗传稳定性地研究.pdfVIP

园艺学进展 (第五辑) 241 葡萄种质超低温保存后遗传稳定性的研究 赵艳华 吴永杰 李春敏 (河北省农林科学院昌黎果树研究所，昌黎066601) 摘 要 以葡萄试管无性系为试材，从形态学、细胞学及分子生物学三个方面研究了超低温 保存后材料的遗传稳定性，从而为葡萄种质的长期保存提供了技术依据 关”葡”’”低寒 超低温保存技术为植物种质的长期保存提供了简便而有效的保存方法，是无性繁殖的果 树等作物种质保存的一个发展方向。 葡萄是世界主要果树之一，其种质的保存成为国内外关注的研究领域。近年来法国、日 本、以色列、中国等国家相继开展了葡萄种质的超低温研究，均获得了一定的存活率，为葡 萄种质的长期保存奠定了基础。但超低温保存过程的非常态，是否会引起保存材料的遗传变 异，是确认保存方法有效性和可行性的重要依据。在理论上，超低温条件并不引起变异，但 至今无系统研究。本试验旨在深人研究葡萄种质超低温保存材料在保存后的遗传稳定性，以 推动葡萄种质超低温保存向实用化方向发展。 I材料与方法 试材来源于河北省农林科学院昌黎果树研究所无病毒苗木实验室，供试品种为1994年 建立的LN33试管无性系，超低温保存时间为18个月。包埋干燥法的基本程序是:将继代培 养120d的试管材料置于5℃光照培养箱低温驯化30d，无菌条件下切取其茎尖，放在0.3mol L,0.7.卜L-,1.0.1-L’的蔗糖溶液中预培养各1d，之后移人3%藻酸钠中，用取液器 吸取含一个茎尖的藻酸钠液体滴人0.1molL-的‘氯化钙溶液中，30min后取出凝固的包埋丸， 放人无菌硅胶中干燥5h，装人冷冻管，以0.290min-’的降温速率降至一4090,浸人液氮。 25℃水浴快速化冻2rnin，然后接种到再生培养基上再培养。 1.1形态学观察 将经过超低温保存的材料和对照分别转接在继代培养基上，1个月后定期观察其叶片大 小、叶色、叶形，繁殖系数及生根率;5月下旬将超低温保存前、后生根的葡萄经过驯化后 栽人温室，7月下旬用卷尺和卡尺分别测量两者的株高和茎粗。 1.2 染色体数目观察 将葡萄根尖在0.01%的秋水仙素水溶液中预处理2h,温度18℃一20cC。利用去壁低渗和 Gienusa染色法制片，加二甲苯，镜检，照相。 .13DNA多态性分析 DNA的提取:利用CTAB法提取葡萄试管无性系DNA,l%琼脂搪凝胶电泳检测DNA纯 度，用紫外分光光度计检测DNA浓度。 PCR反应:反应液总体积为25匹，含1倍扩增缓冲液，lmmolL-MgC12,0.25mmo1L- 242 赵艳华等:葡萄种质超低温保存后遗传稳定性的研究 dNTP,0.151mtolL-的‘随机引物，28ng的模板DNA,1UTagDNA聚合酶，用双蒸水将体积补 充到25沁，用251,L矿物油菠盖并加盖。DNA扩增是在M3ResearchThermalCycler(型号RIC 一100)中进行40个循环。每个循环包括94℃变性lrnin,35℃复性2min,72℃延伸2min，最 后一个循环是在72℃下延伸8min。反应结束后，PCR产物置4℃冰箱中保存备用，或直接用 2.0%a琼脂糖凝胶 (I%normalmoleculargrade昭arose十1%NaSiereGTGagamae,FMC)电泳分 离，电极缓冲液为1倍TBE，在94V的电压下电泳约4h，然后将凝胶在5mgL-t嗅化乙锭中 染色30min，在紫外灯下观察照相。每个PCR反应至少重复3次，反应产物凝胶电脉时，用 标准DNA作分子量参照。 2 结果与分析 2.1超低温保存前、后菊萄的效殖与生根情况 我们对超低温保存后的葡萄试管苗与对照进行了形态上的观察，认为经过超低温保存的 试材在叶片大小、叶片颜色、叶片形状上与对照均无区别;另外，对超低温保存后的试材进 行了繁殖和生根。结果表明:超低温保存后的葡萄前三代继代系数仅为1，不能生根，第六 代以后继代、生根才转人正常。这说明极端低温对葡萄茎尖的伤害比较大，需要较长的恢复 期 (见表1)0 表1超低温保存前、后蔺蔺的带殖与生根情况 Table1Prope乎臼.，以侧困d们吐.川”以别戒e试Cry叩reserva山月nadcon仕d 继代培养代数 (代)Subculturet