转TNF-α基因工程鱼腥藻IB-02中重组质粒稳定性地研究.pdfVIP

莲宁-史t 套国瘁耳生番蕞木与略耳焉曲学术奎议语文暴 2006．8．2-6 转1TqF吨基因工程鱼腥藻IIM)2中重组质粒稳定性的研究 童艳10张艽克3冉亮3邓元告1赵*贵1宋东辉1张越男1王昌禄4施定基10，’ 中国科学院植物研究所，北京100093；4天津科技大学食品与生物技术学院，天津300457 摘要：为利用已经构建的转TNF．Ⅱ基因的工程鱼腥藻IB-02制备口服荆，必须了解工程藻中重组质粒 的遗传稳定性．应用匀泉法，将每一代次无选择压力下培养的含pMD-489-TNF重组质粒的丝状体转 基因藻IB．02处理成单细胞后，采用无选择压力下平板稀释涂布培养，选择压力下挑单藻落于试管中 TNFt口服剂的理想工程菌。 关键词：转基因鱼腥藻lB．02．重组质粒，分配稳定性、结构稳定性 蓝藻又称蓝细菌，其细胞结构与遗传性质同革兰氏阴性细菌相似…，近30年来，科学家们对蓝藻 的光合固氮、分化等复杂过程进行了大量的分子水平的研究，为蓝藻遗传工程的发展奠定了基础。蓝 藻已同大肠扦菌一样成为了理论研究的重要模式生物，而且在生物工程技术中具有大肠杆菌不可比拟 的优势pI。 肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor，TNF)是由人和哺乳动物巨噬细胞和单核细胞受到刺激 后产生的一种多功能蛋白质细胞因子，它具有多方面的生物学活性，其中最引人注目的是它对肿瘤组 织和肿瘤细胞直接和广谱性杀伤作用。 构建了转基因工程鱼腥藻IB．02，2003年把实验室搬天津科技大学进一步开展TNFⅢ口服制剂的中试 成功转入鱼腥藻7120后，一直以硫酸新霉素作为选择压力进行保种传代．从而使转基因藻能稳定存 立生产用的种子库为制备重组TNF口服荆提供必耍的数据。 1材料和方法： 1．1材料 1．1．1藻种： 7120)．由中国科学院植物研究 含pMD-489一TNF重组质粒的lB．02转基因藻(Anabaenasp．PCC 所张艽艽等人2000年构建，本研究室保存．并一直在23C恒温光照条件下以含硫酸新霉素的BG．11 (．N)141培养液保种传代。 1．1．2主要试剂： 硫酸新酶素、Taq酶等购自日本TaKaRa公司。质粒抽提液按《分子克隆实验指南》151配制，蛋 白提取液按《蛋白手册》lel配制 1．2方法 71 1．2．1转基因工程藻IB-02中重组载体的分配稳定性测定1 71 1．2．2转基因藻111-02中重组载体的结构稳定性测定1 1．2．3目的基因PCR扩增：按所购DNA聚合酶内附带的说明抒操作 项目采菲：天津市科委科技重戈攻关项目【3015080)；‘通讯作者：E-mail：盟4业曲i：莓12§￡Q丑：Tel：022 204 4寺·五噍 奎日露耳生曲技术与瘁肆焉■学术套诅静文l 2006．8．2_6 1．2．4无选择压力下传代对重组蛋白表达的影响 1．2．4．1蓝藻租蛋白的提取阁 1．2．4．2蓝藻总可溶性蛋白含量按Bradford法进行测定槲 1．2．4．3转基因工程藻IB-02中TNF-．a目的蛋白的测定 用酶联免疫试剂盒，利用酶标仪测定目的蛋白noFⅢ的含量。测定方法按照所购试剂盒及酶标仪 说明书进行。 2结果与分析 2．1转基因藻IB-02中重组载体的分配稳定性 由于外源质粒的存在增加了宿主细胞的代谢负荷，使得野生藻的比生长速率总是要高于含重组 载体的转化藻，因而在无选择压力的条件下，不含重组载体的野生藻逐步占据优势，即使载体丢失频 率很小．在经过数代培养后，也会出现大量的无载体的野生型细胞。如果当接入的种子藻中畲有无载 体的细胞时，引起的后果则更严重。为了解转基因藻的分配稳定性情况。我们对转基因鱼腥藻7120 在无选择压力下进行传代培养，测定了每一代培养物中重组质粒的分配稳定性(表1)： 表1含pMD-489-TNF重组质粒的转基因藻IB-02中重组质粒的分配稳定性 高的分配稳定性。