小黑杨转双价抗虫基因地研究.pdfVIP

中国造纸学报2004增刊 2004中国科协学术年会第十一分会场论文集 小黑杨转双价抗虫基因的研究术 刘桂丰 常玉广董京祥 (东北林业大学林学院哈尔滨150040) 摘要用根癌农杆菌介导的叶盘法，将蜘蛛杀虫肽与疣基因c肽序列的融合基因导入小黑杨(Popu]us 阳性，Southern杂交检测的结果2株为阳性。抗虫试验结果显示，3个转基因株系均具有明显的抗虫效果， 能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育，表现出强烈的抗虫作用。 关键词小黑杨；转抗虫基因；饲虫试验 我国杨树转抗虫基因的研究已有10余年的历史。人们先后成功地将苏云金杆菌(鳓杀虫蛋白基 洲黑杨、欧美杨、美洲黑杨、毛白杨杨树品种，获得了对杨尺蠖、舞毒蛾、舟蛾类等食叶害虫有毒 杀作用的杨树转基因植株。在抗食叶害虫转基因研究中成绩显著，有的杨树转化体己被国家林业局 批准为新品种，并批准进行商品化生产。这些转基因杨树目前已经在西北、华北等地区的多个试验 点进行了造林区域性试验。但杨树品种的栽种具有地域性，专门针对东北寒冷地区杨树转抗虫基因 的研究尚未见报道。本文采用蜘蛛杀虫肽与Bt基因c肽序列的融合基因，以黑龙江省广泛推广的 抗寒能力强的小黑杨作为转化受体，进行小黑杨转抗虫基因研究，目的在于培育出适合东北地区种 植的杨树转抗虫基因新品种。 1材料与方法 小黑杨(Populus 验室馈赠)，该载体含蜘蛛杀虫肽基因与Bt基因c肽序列，长度为1．3kb。 采用本实验室已建立的农杆菌介导的小黑杨遗传转化方法进行小黑杨的遗传转化。农杆菌 养基上脱菌选择培养。将获得卡那霉素抗性无根苗移入生根选择培养基(MH培养基，附加 打开瓶盖，放入塑料大棚炼苗3～4d。然后从瓶中取出幼苗，小心洗去附着在根部的培养基，种植于 子等量混合的基质中，幼苗放入相对湿度为90％左右的塑料大棚中遮荫培养。 转基因植株分子生物学检测采用CTAB法提取转基因小黑杨总DNA，用小量质粒快速抽提纯 杀虫肽基因与Bt融合基因两端特异序列为引物，以pYHY质粒上的目的基因片段为阳性对照，未 +基金项目：国家转基因植物研究与产业化专项基金(J2002一B一004)。 428 中国造纸学报2004增刊 2004中国科协学术年会第十一分会场论文集 ／L mmol／L 10×缓冲液，1．5 4×dNTP，2m 延伸2min，共计30个循环，最后72℃延伸7min。反应产物于0．8％琼脂糖凝胶电泳检测。 I和BamHI双酶切得到的1．3kb PCR—Southern杂交检测的目的探针是pYHY质粒DNA经Kpn 基因片段，按Boehringer公司的地高辛标记和检测试剂盒进行杂交和检测。 I和BamHI双酶 Southern印迹杂交检测是将转基因小黑杨和未经转化的小黑杨总DNA经Kpn 饲虫材料为移栽3个月的转基因小黑杨，共计3个转基因株系，每个株系任选1株为试材，以 未转基因小黑杨为对照。测试昆虫采用人工孵化2龄的舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫，进行套笼试 统计试验结果，计算幼虫平均体重及校正死亡率，校正死亡率=(参试昆虫死亡率一对照死亡率)／(卜 对照昆虫死亡率)×100％。 2结果与讨论 2．1小黑杨双价抗虫基因的遗传转化 农杆菌LB4404(pYHY)转化的小黑杨在含40mg／L卡那 霉素和700mgCL的头孢唑啉钠脱菌选择培养基上培养3周 后，未经转化的外植体叶片逐渐变黄，少数的转化叶片则产 图1转基因小黑杨的PcR扩增电泳图谱 生绿色的愈伤组织，第30～40d时愈伤组织分化出不定芽， 继代培养1个月左右，切取长约2cm的转基因幼苗，移至生 (对2k照b,，兰譬署翟．o乓篙嚣；佳№’o．I)L20。o：b) 根培养基中似H+0．4mg·L。IBA+40mg·L’1