重组细胞色素P450+BM-3的表达与初步纯化研究-.pdfVIP

重组纲臆色素P450BM-3的表达及初步纯化研究宰 黄俊梅乐和林嫩强姚普潍 (浙巍必学仡学王纛与生耪王纛擘系，撬撼，310027≥ BM-3基躐工翟蓥熬壤券条律避簿’}单嬲索烧纯，确定了鞍毽戆 携要：烈越缝缨脆色素P450 左右时升温至42cE诱导，诱群时间为5小时。用ResourceQ阴离子臌析介质对精体破胞激进 褥了翘梦懿缝诧，邋过．K_KTA explorerl00对其分离条箨进抒彳魏讫，结果表骥：0．3mol／L、 0．5mol／L的两步NaCI阶跃洗脱，基标獯盘纯度鞍高，活性收率兔30。l％，纯诧倍数鸯2。12。 关键词：细胞色鬻P450BM*3；表达；纯化；离予交换层桁 绥魏惫素P450楚一类逐隳态与CO结舍垂在渡长450am楚喜啜教蜂懿含斑缀蓑蕊摹链蛋 白质H1，是自然界最具催化体用多样性的生物催化剂珏1，它的底物包措药物、粪潲醇、致瘸物、 BM．3 除草剂、脂肪酸期杀虫剂等滞l，广泛分布予动物、植物和徽生物的器官和组织巾。P450 BM．3的血红素和黄素部位的结 酶系的粥Ⅱ类酶陆瓤。Buddupalli，S．st31瓣通过对细胞色素P450 BM*3已作为哺乳动物微粒体 构分析，宅与微粒体细胞色豢P450有缀离的相似性，现在P450 P450攀瓣蓑鹜重簧戆模銎。绩鹳P450 BM-3的培养条件进行优化，并对P450BM*3的纯化进行 达。本嶷主要对熏组细胞色潦P450 了初步研究。 1耩料与方法 1．1试剂与仪器 鑫KTA 100分离缚绝交邃舞糍系统、ResourceQ会曩羧我爆嚣彗≤XKl6x20)均 explorer 赌自瑞熊AmershamBiosciences公霹；Hoefer鬣白质电泳仪与GelDoe2000凝胶图像髓瑷系 统均为溅国BIO．RAID公司产品。蛋融质Marker购自上海生工，其余试剂为刚产分析纯。 薹耋蓥释穆蠹蕴 coli D。 菌种为E DH5a，糍达重组绷臌色素P450BM一3的质粒由德豳斯图加特大学Roll Schmid教授惠赠。 1．3墙葬基 种子培养基：LB液体墙养基。固体培养基；向种子培辩基中加入8鐾，L琼脂。，发酵培养基： 冀辫子培养基。 1A培养方法 将保藏的甘濑管菌种，槎乎板上划线得到单趟落，挑取单菌落移接种子液(在250mL锥 养好的种子液攘种于发辩培养基中(在250mL锥形瓶中装入50mL发酵培养湛及 100tag／mL豹氡苄鬻霉素)，转速150r／min，37℃培养，_42℃诱导。 联系人：梅乐和．第～作者：黄忮。男，25黟。博士研粼懋． *DAAD-CSC交溅项目资助． 119 1．5分析方法 菌体浓度测定：以光密度(OD)表示，测定在波长578nm处的吸光度，确定菌体浓度。P450 BM一3的表达水平。P450BM-3酶 胶浓度为10％，浓缩胶浓度为6％)，电泳扫描，分析P450 活测定方法：参考文献【6】。总蛋白的测定采用Braford法口1，用分光光度计在595nm测溶液的 吸光度。 8．0， 上柱初酶液的制备方法：发酵液在4。C、8000r／min冷冻离心10min，收集菌体用pH Iris—HCI的缓冲液以l：6的体积比复溶，在冰浴中超声破碎。其工作条件为：200W的功率， r／rain离心半小时，取上清，即 5秒间歇，5秒工作时间，破碎次数7