真菌DNA序列分析参考文献.docVIP

绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究 谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君 摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养中对应的位置。通过、和对麦曲中的真菌分离，共得到24株真菌。三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为8种、18种、11种和×104 cfu/g曲、×104 cfu/g曲、×104 cfu/g曲。不同的培养基分离出来的优势菌不一样每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。绍兴黄酒麦曲微生物群落结构DNA提取核糖体基因间隔区分析 (RISA)分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。传统的分离培养方法[]对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。麦曲中的微生物群落结构及微生物种群之间的相互影响的关系即微生物生态还未见研究报告。初步研究 1.1 麦曲样品的收集与保存 黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲JH。样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取500 g放入塑料袋中，保存于4 ℃备用。 1.2 分离培养基 土豆琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、定容至1000 mL、pH自然。 察氏培养基（CPK）：NaNO3, 2 g、 K2HPO4, 1 g、KCl, 0.5 g、MgSO4·7H2O, 0.5 g、FeSO4·7H2O, 0.01 g、蔗糖30 g、定容至1000 mL。 麦曲浸提液培养基(WQE): 500 g 粉碎的麦曲样品，加入1500 mL蒸馏水，100 ℃煮沸1 h 后，用四层纱布过滤，0.1 MPa下灭菌20 min备用[2]。 三种培养基中均添加去氧胆酸100 mg/L、链霉素3 × 104 U/L分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为15 g/L，0.1 MPa下灭菌20 min。 1.3分离培养0 mL磷酸盐缓冲液中(PBS, 137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, pH 7.0)，轻轻振荡10 min。取上清液分别用PBS作梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。 平板稀释分离：取不同稀释度的样品100 μL，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。 液态培养基富集：取不同稀释度的样品1 mL 分别接入(接种量为10%, v/v)到装有9 mL各种培养基(PDA, CPK 和 WQE)的试管中，在30℃下振荡培养2天。 1.4分离获得的真菌真菌基因组DNA的提取 30℃摇瓶过夜。将摇瓶培养物抽滤后，收集菌丝体，超纯水洗涤3遍后，转入7 mL离心管中，加入2.5 mL提取液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0; 40 mmol/L EDTA，pH 8.0; 2% SDS)振荡混匀后，再加入1 mL 10% SDS和2 mL氯化苄，50℃保温1 h(每10 min上下颠倒混匀)，加入1 mL 3 mmol/L的NaAc，冰浴15 min，9,800×g离心15 min，取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置20 min，9,800×g离心15 min，弃上清，加入70%乙醇洗涤，离心15 min，弃上清，室温放置15 min后，加入50 μL TE溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.4.2 ITS-PCR扩增 真菌的ITS(内转录间隔区)扩增参照White等[4]的方法。引物pITS1：5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，pITS4：5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’来扩增真菌的ITS保守序列。PCR上海申能博彩生物技术公司pITS1、pITS4各10 pmol/L，DNA模板量1 μL。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统拍照。小量琼脂糖胶回收试剂盒上海华舜生物工程公司，与p-T载体连接 ×连接酶缓冲液和1.0 μL的T4