流行性感冒嗜血杆菌诱导人气管黏膜上皮细胞分泌与表达细胞因子的研究.pdfVIP

盟美蹙苤盔金塞速 垒垦盟整壁鎏：壁堡垂塑：塑监塞塑缉 流行性感冒嗜血杆菌诱导人气管黏膜上皮细胞分泌和表达细胞因子的研究 第二军医大学附属长征医院呼吸科(上海，200003)黄海修清玉钱建美 不可分型流感嗜血杆菌(N啪)是需要复杂营养的革兰阴性球杆菌，它是慢性支气管炎(简称慢支) 和慢性阻塞性肺疾病(COPD)中最常见的相关致病菌之一。细菌与呼吸道作用，首先与呼吸道黏膜上皮 细胞相互作用，刺激炎症介质的释放及炎症细胞浸润，导致呼吸道炎症发生。我们研究目的是将活的完 整NTHi直接作用于原代人的气管、支气管黏膜上皮细胞，观察细胞分泌和表达细胞因子变化。 产临床药品。ATCC49247 NTHi为本院标准细菌株。 备用。 培养基配制：在DMEM／F12中加入10INS、0．1 HC、10 TF、20 T3、25 t,g／ml vg／ml Ve．／ml ng／mi r∥IIll EGF、7．5 mmol ECGS、lmmol／L谷氢酰胺、100IU／ml青霉素、100 HEPES为无血清 t,g／ml m,／mi链霉素、30 培养基(cM)。 NTHi的准备及实验分组：取ATCC49247 NTHi标准菌株，接种于改良的哥伦比亚巧克力琼脂培养 加入0．1 mmol地塞米松为4组及10scfu／ml gg／nd红霉素、10tg,／rnl红霉素、100gs／ml庆大霉素、100 1640。 pg／ml红霉素组、正常对照组，培养基为RPMI 气管上皮细胞分离、培养和细菌感染：气管上皮细胞分离和培养参照REENwu及Tournler等方法。 000 新鲜气管、主支气管标本取自意外死亡的健康成人。在无菌条件下，用含1 IU／nd青霉素、 l000 pg／rI】l链霉素的无菌生理盐水反复冲洗3—4次，纵向切开气管、主支气管，机械剥离黏膜层，尽量 剪成小片，置于含0．1％蛋白酶XWDMEM中，4℃消化18小时。用旋涡震荡器剧烈震荡消化后的黏膜 碎片lo余秒，10rI】l吸管轻轻吹打数分钟，加FCS至终浓度为5％终止酶反应，经80目尼龙膜过滤，去掉 000 黏膜碎片，1 r／rain离心10分钟，弃上清，同上洗涤1次。 用含5％FCS的CM彻底悬浮配制成细胞悬液细胞，细胞计数板计数，锥虫蓝拒染法检测细胞活 件下培养24小时后换成无血清培养基，隔天换液1次，直至约第9天细胞融合基本长满。换为无抗生 素无氢化可的松CM培养24小时后，加入以上准备各组培养基，每组4孔，在5％C02、37C恒温孵箱中 培养24小时，分别留取各孔中培养基及加人细菌前培养基置人一800C冰箱待测白细胞介素8(IL-8)、 Ket 18免疫组化染色。 1640 A549细胞株培养和感染：As99细胞株接种于25IIll培养瓶中，加人含10％小牛血清的RPMI 培养基，细胞融合后o．25％胰酶消化传代于含盖玻片(24nlm×24mm)的6孔培养皿中，细胞基本长满 后分别加入以上准备3组培养基培养24小时，留取培养基，储存于一800℃直至检测细胞因子，玻片经 PBS冲洗2次后，用75％酒精固定半小时，行c瓯免疫组化染色。 一如一 全垦盟韭盛鏊：!墨垂塑：塑造塞堑绳 盟叠壁苤盘金塞煎 实业公司(进口分装)，严格按试剂盒说明书进行操作。 免疫组化染色：各组固定细胞经H2嘎阻断过氧化物酶活性后，以非免疫性动物血清封闭，分别与一 DAB显色，苏木精复