检测四种猪呼吸道常见细菌病复合PCR实验室方法建立.pdfVIP

兽医部分 539 检测四种猪呼吸道常见细菌病的复合 PCR实验室方法建立+ 陈小玲，徐福洲，米丰泉，杨兵 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京，100089 敏感性同已报道的单PER不相上下。该方法的建立将有助于临床上进行这四种疾病的鉴别诊断和对混合感染的检 测。 关键词：复合PCR；猪胸膜肺炎放线杆茵；猪多杀性巴氏杆菌；猪肺炎支原体；副猪嗜血杆菌 同繁殖障碍性传染病、胃肠道传染病一样，呼吸道传染病是危害养猪业的三大症侯群之一。近几 年来随着规模化养猪业的发展，呼吸道疾病呈递增趋势。目前国内兽医临床对猪呼吸道几种细菌病的 诊断仍普遍采用传统的病原分离鉴定和血清学方法，但病原分离和生化鉴定不仅费时费力，而且敏感 性和特异性都较差。血清学诊断方法不能在病的早期得出结果，也可能因实验室的不同而产生检验差 PCR诊断方法的研究。 1材料与方法 1。1菌株和培养方法 Blaekall博：上惠赠。培养用LB培养基或营养琼脂，加 APP、PM、HPS几种血清型参考菌株由Pat 入5％dx牛血清和0．5％的NAD。MHP液体培养物来自中国兽药监察所。 1．2检测样品的制备 用接种环从固体培养基上挑取微量菌落直接加到PCR反应液中或挑取数个菌落悬浮于含100／d 000r／min离心 超纯水的离心管中，震荡混匀，95。C加热10min或煮沸10min后置于冰上冷却，12 物用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)提取2次和无水乙醇沉淀DNA。 1．3多重PCR引物的选择 通过查找国外研究报道中已经建立的针对这4种病原菌的单PCR方法，选择特异性敏感性好、样 ·北京市科蚕合同项目(1-1012810010113)资韵。 540 2005学术年会 品制备简单、PCR扩增产物易于区分、PCR条件相近、有临床数据并且应用前景看好的参考文献，采用 其中已发表的引物序列[1“]： APP(342bp)：弓I物P1：GATAAACCTTTTCCGGAATT 弓l物P2：TACCACACCGTGfrTTATCAA PM(457bD)：弓l物P3：ATCCGCTATTTACCcAGTGG 引物P4：GCTGTAAACGAACTCGCCAC HPS(821bp)：弓I物5：GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 引物P6：GGCTTCGTCACCCTCTGT MHP(649b)：弓I物P7：GAGCCTTCAA(；CTTCACCAAGA 引物P8：TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC 1．4复合PCR反应条件 1．5mmol／L，自配)、2．5mmol／L dNTtr2．0#1、10,ttmol／L引物各1．O弘l、5u／,ttlTaq酶0．2弘l、模板各1．opl， ddH20加至25．0t4。 个循环后72。C终延伸8min，产物于4℃保存。 1．5 PCR的敏感性和特异性 APP、PM、HPS ■ 板。 复合PCR扩增纯化DNA样品的敏感性。 用本实验室保存的APP、PM、HPS菌株和猪呼吸道常见的细菌如大肠杆菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、 奇异变形杆菌等为模板做复合PCR，检验该方法的特异性。 2结果 2．1 复合PCR引物的研究 Premier 这几对引物只与相应被检测的病原菌有高度特异性。用Primer 5．0软件对这几对引物的 Tm、二级结构、GC％、二聚体形成等参数做了分析。 2．2复合PCR条件的优化 火温度、各引物用量、dNTP用量、Taq酶角量、模板的浓度用量和PCR程序，最终选定了使用自己配制 的pH u 兽医部分