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西罗莫司高产突变株PC904-33 黄捷金东伟余辉程元荣 (福建省微生物研究所福州350007) 三稀大环内酯具有抗真菌和抗肿瘤的活性新型强效免疫抑制剂。除用于器官移植抗排斥药物外，还 用于心血管支架涂料、新合成抗肿瘤抗生素CCI--779的原料药。西罗莫司有着明显的社会效益和经 济效益。在生产过程中，西罗莫司菌种发酵水平和发酵液付产物情况是关键。我们应用物理、化学 诱变因子联合诱变西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC904，变异株再行对其自身代谢产物西罗莫司耐药 性的处理。变异株通过发酵生物合成的调控，以期获得代谢产物较为单一，发酵单位高的突变株。 1材料与方法 1．1菌种 FC904)，福建省微生物研究所保 西罗莫司产生菌吸水链霉菌FC904(Streptomyceshygroscopcus 存，作为诱变育种的出发菌株。 1．2培养基及培养条件 1．2．1孢子培养 7．0～7．5，自来水 斜面培养基及分离培养基：燕麦片琼脂(ISP3)：燕麦片2％，琼脂2％，pH 配制。 自吸水链霉菌FC904沙土保存管中取出少许保存物或自生长琼脂斜面取出一环培养物接种于 ISP3琼脂斜面上，28℃培养15—20天，斜面表面培养物出现吸水斑，4C保藏备用。 1．2．2种子培养 7．0， 吸水链霉菌FC904孢子接种于种子培养基(主成份为：葡萄糖，酵母浸膏、蛋白胨等，pH 丝呈网状，可作为移种的种子。 1．2．3发酵 3～6ml的种子培养物移入60ml发酵培养基中(主成分为：葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉、蛋白胨等， pH6．0，三角瓶500m1)，28C、220rpm振荡培养8496h，进行效价测定。 1．3西罗莫司的检测 1．3．1甲醇初提液 发酵液经甲醇初提后进行生物效价测定和，或HPLC检测，初提方法见程元荣等吃’的报导。 1．3．2生物效价检测 生物效价的检测采用纸片半固体琼脂扩散法，见黄捷等的报导‘31。西罗莫司工作标准品由福建 省微生物研究所制各，经中国药品生物制品检定所标定，纯度：99．8％。 1．3．3 HPLC检测 151 HPLC检测采用外标法。HPLC检测仪：BacmanGold，色谱柱：ODS System C18，流动相：甲 醇一水(75：25)，检测波长：277nm，柱温：40℃。 1．4物理、化学诱变因子联合处理吸水链霉菌FC904 步骤： 甲基磺酸乙酯(EMS)处理一 紫外线(UV)照射一亚硝基胍(NTG)诱变一 自身代谢产 物(西罗莫司)耐受性菌落筛选 1．4．1uV和NTG联合处理吸水链霉菌FC904孢子 10ml孢子悬液装入9 8．0缓冲液)中28C避光处理2～3h。终 射10秒后，再用3mg／mlNTG(采用0．1mol／LTris·C1pH 止反应后，孢子悬液重新悬浮于生理盐水中，稀释并涂布在ISP3琼脂平板，28℃培养10--一15天。 1．4．2 EMS处理突变株27#发芽孢子和西罗莫司抗性菌株的筛选 1．4．1处理获得的突变株27#孢子接种于发芽培养基(葡萄糖1％、酵母浸膏0．6％，蛋白胨0．6 ％，KzHP04·3H200．1％，MgS04·7H200．05％，pH 7．0的 镜观察有逗号状芽头，10000rpm离心10分钟，弃上清液，收集发芽孢子，用0．1mol／L、pH 磷酸缓冲液洗涤，最后悬浮在含0．5mol／L