牛脑中未知神经肽的提取、分离与结构研究.pdfVIP

LC-128 牛脑中未知神经肽的提取、分离及结构研究 赵莹歆赵睿水上官棣华熊少祥刘国诠 (中国科学院化学研究所化学生物学联合实验室北京100080) 神经肽是生物体中广泛存在的一种化学信使。它们的作用广泛而复杂，不仅在脑内执行 高级功能，如学习加工、识别和记忆、睡眠和觉醒、抑郁和愉悦、紧张和镇痛等， 而且在 诸如内分泌系统、自主神经系统和免疫系统等的活动中，也起着重要的调控作用。据预测， 神经系统中的活性肽不少于300种“’，但到目前为止，仅发现了数十种，这主要是由于神经 肽在生物体中的含量极少，一般仅为pmol／g组织，而且在复杂生物体系中，许多生化和化 学的因素，也限制了对神经肽的研究。神经肽的发现和分离经历了艰难而曲折的过程。1969 个被分离纯化并阐明结构和功能的下丘脑肽激素。 为了克服早期的神经肽研究中极其艰难的分离、提纯工作，发展用于神经肽的高效、高 选择性分离分析的新方法，从较少量的动物组织中发现新的神经生理活性肽，并阐明其结构 与功能的关系，我们以牛的脑组织为研究对象，开展针对神经肽的超痕量分离分析的研究。 建立了从牛脑中分离、提纯神经肽的新流程，组合利用超滤与多级色谱分离，并与MALDI—TOF 硒离线联用，获取脑内小肽的指纹谱，利用ESI-MS—Ms在牛脑提取物中发现了5种未知的 多肽，并测定了其一级结构。 1从牛脑组织中分离、提纯生理活性多肽的新工艺 神经肽的研究涉及快速的生化过程，在对动物模型的处理，生物组织的加工过程中，许 多内外界因素会造成蛋白质和肽类物质组成和结构的变化，且这种变化会随时闯的延长而加 剧，同时，外源性的染菌，也会造成实验的失败。在本研究中，针对生命终止及酶解过程的 特点，采用现场采样和现场微波灭酶法，以抑制组织和血液中的蛋白酶的活性。选用最适宜 于大型动物的放血屠宰方式，这样可以快速地使血液中的酶失活；屠宰牛并切割下头部后， 快速地分离出脑组织，用微波处理，使脑组织中的蛋白酶快速失活，以最大限度保存内源性 生理活性肽不遭破坏。采用中空纤维超滤膜技术(截止分子量为i0，000Da)、凝胶过滤色谱 (分子量范围为100～10，000Da)进行了脑组织粗提物的分离、纯化，以除去生物大分子 及单胺类、氨基酸和无机盐等。超滤速度可达4—5升／小时。由于脑内多肽的分子量一般较 小，最有价值的肽的分子量范围在500—2200Da之间，将在这一区间收集的凝胶色谱洗脱液 合并后，冷冻干燥，进行下一步的RP-HPLC分离。 2脑内小肽的指纹谱 MS)是分析混合肽的 近几年发展起来的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI—TOF MS 有力工具，样品中的各个组份在测定分子量之前，可不需进行纯化。在进行MALDI--TOF 前，为了避免疏水性多肽与亲水性多肽间的干扰，对样品进行了RP—HPLc分离(图1)，通 过MALDI—TOFMs检测，获取脑内小肽的指纹谱后，与所建立的已知神经肽库对照，初步确 定了40余种已知的神经肽如甲硫脑啡肽、皮啡肽、催产素、缓激肽和亮脑啡肽以及来源于 350 表11。峰的Ms结果与已知神经肽库的比较 分子量 [邮州 [M]+Na [蜘垤 612．54 甲硫脑啡肽 626．57 LANVST 633．58 ASHLPS 642．53 LANVST 649．60 M㈣S 770．57