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鸡早期胚胎发育规律和干细胞培养及其转基因的研究 ! 鸡早期胚胎发育规律和干细胞培养及其转基因的研究 中文摘要 随着鸡胚胎和遗传工程的快速发展，迫切需要鸡胚胎发育规律的统一判断依 据和标准，以及对鸡早期胚胎在体内的生长发育规律和早期胚胎细胞体外生长能 力的掌握。本实验通过对鸡早期胚胎发育研究，以探索鸡胚胎生长发育的规律性； 采用不同方法分离鸡胚胎干 Es 细胞，同时观察鸡Es细胞对不同酶消化的耐 受性、Es细胞体外培养和传代的能力；采用显微注射法将人生长激素 hGH 基 因和人组织激肽释放酶 KLKl 基因直接注入发育鸡胚的胚盘中，研究Es细胞 转染外源基因的能力，为禽类胚胎发育生物学研究以及转基因鸡生产提供素材和 新途径。研究结果如下： l、鸡早期胚胎体内发育规律的研究：在鸡产蛋后的不同时间段内分别将鸡处 死，从输卵管或子宫内取出发育的受精卵，显微镜下观察并记录。结果显示：受 精卵的第一次分裂发生在产蛋后5h O．0．5h子宫龄 ，桑椹期形成在产蛋后 发育的变化，可将鸡胚在体内发育过程分为两个时期：一是在距前一个蛋产出后 成期，即鸟类的囊胚期，结果在胚盘中央形成透明的周围不透明的明区和暗区。 对鸡ES细胞培养或制作嵌合体鸡，根据需要可在不同的时间获取所需卵裂球或 胚胎，早期囊胚阶段即在分裂期的lO．5h子宫龄前可获取较大卵裂球，在12．5．13．5h 子宫龄后可获取较小的卵裂球。 2、对鸡ES细胞分离与培养的研究：采用药勺获取、单独酶解离法分离得到 的鸡第X期 24-26h子宫龄 胚盘细胞，接种到四种不同的培养体系中。比较不 同的培养体系中各种因素对ES细胞培养传代的影响。实验结果表明：在无饲养 层，培养液中不添加外源性细胞因子的培养体系1中。无ES细胞的AKP阳性克 鸡早期胚胎发育规律和干细胞培养及其转基因的研究 ! 隆形成；在无饲养层，培养液中添加细胞因子培养体系2中，培养72h后有一代 重新聚集形成集落；在以鸡胚胎成纤维细胞为饲养层，培养液中不添加外源性细 胞因子的培养体系3中，培养48h后可见细胞成集落状隆起生长，但传至三代后 未观察到Es细胞集落形成，第一代和二代ES细胞的AKP阳性克隆形成率分别 为40％和20％。与其它三个培养体系相比，在以鸡成纤维细胞为饲养层，用添加 了10％的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／LL．谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、 5．5×10．5mol／L inhibitory 制因子 Leukemia cell growthfactor-basic。bFGF 和5ng／rnl干细胞生长因子 Stem DMEM培养体系4中，培养约扣3d时开始出现鸟巢状的Es细胞集落，以多次离 散法进行传代获得了传至5～6代的鸡Es细胞克隆。AKP阳性克隆形成率与其它 三个培养体系相比，存在着极显著的差异 P o．01 。通过对传代培养后的鸡Es 胞的特征。 3、对鸡胚盘内转染外源基因的研究：采用显微注射法，分别将人生长激素 出雏鸡18只，孵出率为5．6％。8只雏鸡分别于出壳后的第一、二、三、五天死 亡。7只于3月龄死亡。3只鸡存活并正常生长。死亡雏鸡具有脚瘫、体弱、斜颈、 站立不稳等异常表现，存活鸡无外观异常。从孵化4d后死亡的150枚鸡胚和18 只出壳雏鸡的组织中提取基因组DNA，并用DNA杂交试验进行基因整合检测， 结果发现其中的3枚鸡胚和3只雏鸡为人生长激素基因整合阳性，基因整合率为 鸡胚盘内细胞通过显微注射法可以转染外源基因，是转基因鸡制备的一条有效途 径。 关键词：鸡；胚胎发育；胚胎干细胞；培养；传代；显微注射；转基因。 鸡早期胚胎发育规律和干细胞培养及其转基囡的研究 一3 of RulesChicken andthe EarlyDevelopment Embryo Related TransgenicTechnology Abstract：Withthe of and in rapiddevelopmentembryonicgenetic chick, engineering in theleseachthe demandsunifonTI embryonic a criterionforthe development biology rulesin the chick,andreseachonthe embryonicdevelopment early．stageembryonic rules／nvivoor／nvitroinchickis forfowl and development necessary breeding the onthe and research．Through transgeni