醛基二茂铁标记DNA电化学探针对DNA损伤作用地研究.pdfVIP

分析化学的成就与挑战 醛基二茂铁标记DNA电化学探针对DNA损伤作用的研究 何品刚榇謇蔡宏方禹之 (华东师范大学化学系上海200062) 关键词羟基自由基DNA的损伤电化学探针 羟基自由基(·0H)是生物体内危害晟大、活性最强的氧自由基，可以使糖类、氨基酸、蛋白 质、核酸和酯类等发生氧化，还与衰老、肿瘤和辐射损伤等有关Ⅲ。DNA电化学探针法快速、灵 敏、操作简便，可以通过电极表面杂交反应选择性识别DNA片断[21，是理想的快速检．坝UDNA结 构变异的方法之一。本文将单链DNA分子富集在石墨电极表面，采用核酸分子杂交技术，将经电 极表面的单链DNA分子进行杂交反应，研究了Fenton反应产生的羟基自由基对作用及自由基清除 剂对DNA损伤的保护作用。 1羟基自由基的生成及对单链DNA的损伤作用 合液中，展后加入H2Ch，在35℃保温60 基自由基对富积在电极上的单链DNA产生损伤作用。 2自由基清除趔对DNA损伤的保护作用 将富集了单链DNA的石墨电极浸入含有EDTA，FeS04，磷酸缓冲液的反应混合液中，分 min。 别加入羟基自由基的清除剂硫脲、苯甲酸钠和异丙醇，最后加入H，o。在35℃保温60 3杂交反应 分别将已富集了待测单链DNA片段(经损伤作用后的单链DNA及经自由基清除剂保护作 行杂交反应，42℃恒温均匀搅拌lh。取出后用SDS清洗液清洗3次后进行电化学测定。 4电化学测定 采用三电极系统，铂丝电极为对电极，Ag／AgCl电极为参比电极，杂交后的石墨屯极为工 V~1．0 作电极．TE溶液为底液，记录在0．0 v范围内的差分脉冲伏安(DPV)曲线。 5羟避耋自由基列单链DNA损伤作用的电化学检测 Fenton反应是产生羟基自由基的常见方法，总的反应方程式可表示为： 本文在磷酸EDTA体系中利用该反应产生的羟基自由基对富积在电极上的单链DNA产生损伤作 用，然后与FCA标记的DNA探针(用未损伤的互补单链DNA进行标记)进行杂交反应。单链DNA 经羟基自由基作用40rain后，进行杂交，然后用电化学检测，发现FCA的还原峰电流明显降低， 表明待测的单链DNA的碱基和脱氧核糖部分或全部受损【4】，杂交反应部分或全部不能进行。 6胪浓度、H20，浓度及保温时间对DNA损伤作用的影响 上述体系中，不加入Fe2+而改加相同摩尔浓度的F矿、cu2+和M矿．DNA链的损伤作用将 l mmol／L～0．6mmol／L 不能发生，说明F矿是产生羟基自由基必不可少的条件。当Fe“张度在n 601 分析化学的成就与挑战 范围内变化时，引起DNA链的损伤程度不断增大直至DNA链全部损伤而不能发生杂交作用，FCA 的还原峰电流几乎降为0。实验中选择F撇度为0．5 mmolFL。再者，DNA损伤作用随H202浓 度的增大而增大，当H202浓度大于0．8mmol／L时，FCA的还原峰电流几乎降为0。实验中选择 H_嘎浓度为O．88 mmol／L。-OH的寿命很短(10。s)，浓度很低(104 tool／L)，因此保温时间的长 min。 择保温时间为60 7自由基清除荆对DNA损伤的保护作用 硫脲、苯甲酸、异丙醇都是羟基自由基的清除剂。本实验观察到上述清除剂对羟基自由基 系统内DNA损伤均有不同程度的保护作用。以‘“Io(其中‘为经自由基清除剂作用后的FCA 的还原峰电流，k为未经自由基清除剂作用的FCA的还原峰电流)计算各种自由基清除剂的保护 作用，结果见表l，与文献嘲的报道基本一致。说明该方法准确、可靠。 表1羟基自由基清除剂对喇^损伤的保护作用