喜树细胞气升内环流反应器培养生长动力学地研究.pdfVIP

喜树细胞气升内环流反应器培养生长动力学的研究 于放张冬艳赵·心清谢健白凤武 (大连理工大学生物工程系，大连116012) 摘要：本文在5L气升环流豆应器中实现了喜树细胞悬浮培养．研完了喜树细胞J恙浮培养的生长动力学 规律．恒速生长期刊出糖的得率乐数为0．3169／g，堆持系数为0．09329／gd：通过洲定生物量和电导率的 变化得出生物量增加与电导率变化的相关系款为2．46x10t．从培养工艺上看喜树细胞生长大致可分为 延迟期、指敷生长期、恒速生长期度减速生长期四个阶段：最大生物量达到12．0579,L． 关t词喜树；细胞培养：动力学；气升内环流蜃应嚣 植物细胞培养用于植物药生产是当前生物工程的研究重点之一口】。在医药工业中．利用植物细 胞培养技术可以进行药用物质的合成及生物转化，甚至产生出新的生理活性物质。喜树(Camptotheca acuminata Decaisne)是我国特有树种，广泛分布在我国南方和印度，其中的生物碱具有很强的抗癌 活性【“。我们通过对喜树外植体的诱导，已经获得喜树细胞的愈伤组织，并通过继代培养得到了适 合悬浮培养的疏松愈伤组织，由愈伤组织出发建立起喜树细胞的悬浮系。本文在此工作的基础上， 对喜树细胞在气升式反应器中的生长和基质消耗进行了研究，为进一步生产次生代谢物提供一定的 控制参数。 1材料及方法 1．1实验材料 1．1．1材料：本实验采用由美国喜树研究所提供的植株，由嫩茎、嫩叶诱导出愈伤组织。经五次继代 后建立起喜树细胞的悬浮系，由此悬浮培养的细胞作为气升式反应器的种子。 mg／L。灭菌前调pH值至5．8。 1．1．3培养方法：分三级培养，第一级为固体培养，第二级为摇瓶培养．第三级为反应器培养。第一 级为光培，第二级和第三级为暗培。培养温度均为25。C。摇瓶培养时采用普通摇床(中科院武汉科 BrunswickScientific 制系统采用Celligen细胞培养装置(New Co．USA)的控制系统，通气量为 0．5L／min，容积为5L。 1．2培养过程中参数的检测 1．2．1电导率：DDS一11C电导率仪(上海雷磁仪器厂)来测定。 1，2．2喜树细胞的密度：用水体积排除法测得喜树细胞体积，然后用细胞质量与之相除而得。 l_2．3固含率：用水体积排除法测得喜树细胞体积．再与总体积相比。 1．2．4通气量：由流量计上直接读取。 1．2．5培养液中含氮量：通过凯氏定氮来测定总氮及铵基氨的含量。 1．2．6培养液中糖含量：通过葸酮定糖比色法来测定。 1．2．7培养液中磷含量：通过比色法来测定总磷和无机磷的含量。 18 1．2．8细胞中的磷含量：通过比色法来测定总磷和无机磷的含量。 2结果与讨论 2．1反应器内培养物的特点 在摇瓶中准备的喜树细胞种子均由直径小于3mm的细胞团及大量的单细胞组成。在培养的过 程中随着时间的延长．喜树细胞有集聚成团的趋势，在细胞生长的对数生长期内细胞生长旺盛，有 大量的单细胞存在。在培养大约18天进入平稳期后培养液基本趋近清澈，单细胞数量大量减少。 细胞团的大小多数均匀分布在2-2．5mm处。 2．2喜树细胞反应器培养的生长规律及生物量与培养液电导率的镜像关系 喜树细胞反应器培养的生长动态如图l所示。喜树细胞在15一18天左右大到最大生物量 drytlht conductivity 图I 生物量旃培养时间的变化规律 图2电导率随培养时间的变化规律 12．0579干重几。图2所示为在培养过程中培养液电导率的变化趋势。可见在植物细胞培养停滞期以 前，细胞生长和培养液中电导率变化呈相反的镜像关系。通过培养液中电导率的变化可间接反映细 胞的生长状况∽I。由图1、2所示，随着培养天数的增加即生物量的增加，电导率降低。 图3表明，生物量的增加与电导 率的降低存在着线性关系，而且在生长静止期 之前有很好的关联，随着培养后期细胞自溶现 象的出现，二者的关联就出现了一些偏差。根 据Tayal6]等的经验公式，生物量增加与电导率 变化的关系可表示为：△C，=2．46X10-2△七 式中小■为生物量的增加(叽)，出为电导率