《分子生物学》实验(17课时).docVIP

（本科）生物科学专业 分子生物学实验 201年制订课程代码： 学分： 总学时： 先修课程：《生物化学》，《有机化学》等。 开课对象：生物科学专业（本科） 一、课程的性质、目的与任务 分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作机能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题解决问题的能力。 二、学时分配 (CaCl2法） 综合 3 pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10与鉴定 综合 4 共17学时 实验一 实验器材清洁灭菌与试剂配制 学习分子生物学实验室规则与注意事项 熟悉相关仪器的使用及操作规程 超净工作台、PCR仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、恒温培养箱、摇床、冷冻离心机、涡旋振荡器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、重蒸水装置、移液枪 三、器材的清洁与包装消毒（每组一份） 1.试管清洗与包装灭菌：用清洁液刷洗后自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗两遍，晾干或烘干使用。取棉花与纱布，制成棉塞，塞好试管口。3只一组用报纸包裹、细绳扎紧，高温蒸汽灭菌。 2.培养皿清洗与包装灭菌：将培养皿清洗干净，晾干或烘干，盖好，4套一组用报纸包裹，灭菌。 3.离心管的包装与灭菌：将100ml烧杯清洗干净，晾干或烘干。取1.5ml及10ml离心管装入烧杯中，包口灭菌。 4.枪头的灭菌：将10ul、200 ul和1000 ul枪头装入配套的枪头盒，包好灭菌。 5.清洗250ml、100ml和蓝口瓶盖盖。装好灭菌。 6.灭菌完毕后取出烘干或晾干，保存备用。 四、试剂的配制与灭菌： 1. LB培养基：酵母提取物 5g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 15～20g；定容至1000mL（NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌）。有时需在培养基中添加抗生素，琼脂凝固点为40℃，所以添加抗生素最好在50～55℃。 2.电泳缓冲液 ：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0） 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸 57.1 ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml 加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。 1×TAE缓冲液的配制： 称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。 溴化乙锭贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶 配制：100 ml 称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。 配制：10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml 用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。 其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖 3. 0.05mol/l CaCl2溶液：称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。 4. 含15%甘油的0.05mol/l CaCl2： 称取0.37g CaCl2·2H2O，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。 5. 取锥形瓶装好双蒸水，包口、灭菌，即无菌水，存放于室温。 6.用脱脂棉制成棉球，配制75%酒精浸泡，置于广口试剂瓶中备用。 实验二 PCR扩增目的DNA及电泳鉴定 实验目的：掌握PCR技术的原理、方法和实验注意事项 二、实验原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以