快速提取细菌DNA方法地研究.pdfVIP

·394· 够。然而，有一点是值得我们注意的，在培养(～)和涂片(一)5％⑦。而John 的病例中，发现有约30％的初治患者SDA阳性，对诊断和判过IAC显示扩增失败，占4．6％。在我们的测试中，有23例 定患者是否具有传播性有一定的意义。PCR反应系统内的 (5．44％)IAC 抑制性一直以来均较重视①⑧⑨，其抑制的程度均只能与菌 液进行倍比稀释，6例出现阳性结果，其中2例通过与培养比 阳病例对比确定。BDProbe Tec分析系统内设立内质控，提 较证实，3例出现持续性抑制。在RT—PCR中，通过与培养 示结果的可信性。GiannaG通过研究认为使用IAC对扩增失 结果比较，发现胸水的抑制率较高(18．75％)，可能与胸水内 败的显示低于1％，原因是对于扩增技术未达到理想而高估 蛋白质含量较高，或加热煮沸时使蛋白质凝固，造成DNA释 抑制因素。另有学者最后得到的总抑制率是5．0％，其中呼 放受阻有关。提示我们在对此类标本进行DNA提取纯化时， 吸性样本的抑制率是4．2％。非呼吸性样本的抑制率是6． 加热煮沸法的阴性结果可信性较差，值得引起注意。 快速提取细菌DNA方法的研究 夏涵府伟灵 陈呜黄庆赵猛赵渝徽王丰 罗阳 目前，感染性疾患仍然是危害人类健康的重要疾患，常见 2．0频率记录分析软件及数据采集系统、电源及其他硬件系 致病微生物的威胁不但没有消除，而且出现了越来越多的耐 统等。 药问题，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等，给临 4．引物和探针设计自行设计细菌的通用引物16s—s、 床治疗带来巨大困难，因此，要求临床微生物检验能够更准 16s—a、巯基化探针P—sa，由上海博亚公司合成，PCR扩增片 确、更快速的检出与监测病原微生物。传统的病原微生物检 段大小为329bp． 测主要依据形态特征和生理性状，需要进行细菌分离、培养及 一系列生化反应，耗时长，操作烦琐，对有些细菌也往往不能 给出理想的鉴定结果，远远不能满足临床对病原微生物感染 二、方法 的诊断的要求。应用压电质量效应原理建立的石英晶体传感 (一)细菌DNA的提取：平板培养细菌用0．9％无菌生理 器技术和PCR等分子生物学技术结合用于检测病原微生物 的检测，具有高特异性、高灵敏度、成本低廉等特点，加快了细 管中4℃8，0009／nfin离心5min，弃上清。 菌检验的速度。本文对四种不同的细菌DNA提取方法进行 1．沸水浴法：将lml细菌菌液置于1．5ml的离心管中， 了比较，旨在选取快速、有效的DNA提取方法，为进一步的压 电石英晶体传感器病原微生物检测微阵列研究打下基础。 模板，一20℃保存备用。 材料与方法 一、材料 30正和20mg／ml蛋白酶K3皿，于37℃温育1h，加入5mol／ 1．菌株来源：金黄色葡萄球菌碱25923、铜绿假单胞 LNaCl 80皿溶液，于65℃温育10min， 菌ATOC27853和大肠杆菌ATCX325922均来自本院检验科 loo}a，CTAB／NaCl 加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀，4C 微生物室。 12，0009／min离心 5min。将上清液转入另一个离心管中加等体积的酚／氯仿／ 2．主要试剂：EDTA、丙酮、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇(购 自中国医药集团上海化学试剂，分析纯)；无水乙醇(购自重庆 一管中，加入0．6体积异丙醇，轻柔混合，4℃12，0009／min 化学试剂公司，分析纯)；溶菌酶、蛋白酶K、CTAB、riffs— 离心5min，弃上清．加入70％乙醇洗涤