Taqman+MGB探针快速定量检测VHSV方法研究.pdfVIP

“京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛，，论文集,f，／J 3结论和讨论 选择链球菌16SrDNA作为靶区域，设计引物和探针建立了猪链球菌通用荧光PCR检测方法。 并进一步对所建立的方法进行了优化。用所建立的方法对以10倍梯度稀释的4株2型猪链球菌培 养物进行检测，结果显示灵敏度可达10—6，经换算相当于10个CFU的细菌即可检出；重复性试验结 果显示所建立方法的稳定性良好；建立的猪链球菌通用荧光PCR检测方法在检测所收集的猪链球菌 全部为阳性，但检测其它细菌的结果为阴性，未发现交叉反应。表明该方法敏感性较高、特异性强。 选择猪链球菌荚膜抗原基冈2J(cps2J)作为靶区域，设计引物和探针建立了猪链球菌2型荧光 PCR检测方法。并进一步对所建立的方法进行了优化。用所建立的方法对以10倍梯度稀释的4株 2型猪链球菌培养物进行检测，结果显示灵敏度可达10—4，经换算相当于100个CFU的细菌可以检 出；重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；建立的猪链球菌2型荧光PCR检测方法在检测 所收集的猪链球菌和其它细菌的结果为阴性，未发现交叉反应。表明该方法敏感性较较高、特异性 强。 研究中，经多次重复，我们发现对于相同的菌株，通用检测方法与2型检测方法的灵敏度差一个 数量级，C．Marois等建立的多重PCR检测方法检测猪链球菌及猪链球菌2型时，灵敏度也存在差异， 这或许与两套引物探针所针对的基因不同有关。 在反应体系的优化过程中，各种反应物的用量对反应的影响较大，特别是M92+浓度对荧光增量 和检测的灵敏度相关，提高其使用浓度，可提高2型检测探针的荧光增量，但对通用型方法的影响不 大；但随着M92+浓度的提高，特别是超过5mM时，在检测某些样品时，可发现曲线上漂的现象。 由于我们建立的方法的目标之一是应用于临床组织样品中病原的检测，但由予生物安全的原因， 没有采到发病猪的组织样品。因此在研究过程中，我们进行了模拟试验，即将培养的猪链球菌2型 (灭活和非灭活)培养物倍比稀释于20％健康猪肝组织悬液，进行检测，结果显示我们通用检测方法 可达到10—5，而2型检测方法为10—4，初步认为可以满足临床样品检测对灵敏度的要求。 在本研究中，我们将建立的方法初步用于临床样品的检测，样品均从某健康猪场随机采集，在对 咽喉拭子的检测中，用通用型方法检出一份阳性，用猪链球菌2型检测方法检测时为阴性，但细菌分 离试验的结果全部为阴性，33#样品未能分离到细菌可能与样品存放时间较长有关；在对108份猪扁 桃体样品检测时，两种荧光PCR方法的检测结果全部为阴性，与细菌分离试验的结果完全一致。 参考文献(略) (此文已在中国预防兽医学报，2007，29(7)发表。) TaqmanMGB探针快速定量检测VHSV方法研究 许建明1 张利峰1 王姝2段向英1张念之3 蒋一男3夏春3 (1．北京出入境检验检疫局 北京 101113) (2．北京市水产技术推广站 北京 100021) (3．中国农业大学动物医学院北京100094) 摘要：为建立准确定量检测病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagicsepticemiavirus，VHSV)的 实时荧光RT—PCR方法，本文在VHSV-N基因保守区设计了TaqmanMGB探针与引物对。随后，采 ∥纷 -·京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛”论文集 用体外转录技术获得了VHSV—N基因RNA，并以此为绝对定量标准品，建立了VHSV的绝对定量检 性好，与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。检测线性范围为1010—102拷贝／反应，灵法度达102拷贝／ 反应。此检测灵敏度比OIE推举的尺r—PCR法高出5个数量级，比嵌套Rr—PCR高出J个数量级。 本法是出入境检疫VHSV的有效方法。 0 引言 病毒性出血性败血症(viral hemorrhagicsepticemia，VHS)是一种危害水产养殖业的重要疾病，属 于世界动物卫生组织(OIE)规定须申报的一种疫病…。VHS主要流行分布于北半球，可感染数十种 鱼类，死亡率可达30—100％[2,3J。VHS病原为病毒性出血眭败血症病毒(viral