D-苯丙氨酸产生菌紫外诱变育种研究.pdfVIP

D一苯丙氨酸产生菌的紫外诱变育种研究 李环 韦萍 (南京工业大学制药与生命科学学院，南京，210009) 摘要 D一笨丙氛酸可以一菌双璐法由恶灸假单胞菌一步合成。本文对该菌进行了紫外与5一蔽尿喀 咤的综合诱史，筛选到一株醉活较高的突变株JS-01-44，转化率由原来的55%提高到65%.5一氛 尿喻健料面连续传代 10次，转化活力保持德定。 关性词 D-苯丙氛故 紫外诱变 5一氮尿啥吮诱变 突变株 D一苯丙氨酸是合成短杆菌肤S等环肚类抗生素的重要原料1i1，也是制备杂环多肚类药物的 重要中间体[=]aD一苯丙氨酸还可作为止痛药、镇静药、免疫制剂药等药物的中间体D[I，被广泛 用于医学领域。D一苯丙氨酸最常见的制备方法主要有拆分法、不对称化学合成法及生物酶 法I。其中最经济的方法当属生物酶法。生物酶法又可分为一酶一酸法、双菌双酶法和一菌双酶 法151。本菌种室保藏菌种恶臭假单胞菌PseudomonasPutidaJS一01含海因酶和氨甲酞水解酶两种 酶，已成功地以此一菌双酶法转化D,L一对经苯海因成D一对经苯昔氨酸，转化率高达90%以 上。该菌种经进一步优化诱导用于5-节基海因生产D一苯丙氨酸，转化率达50%以上。为进一 步提高该菌株的酶活，本文以此优化诱导后的菌株为出发菌株，进行了紫外诱变及5一氟尿嗜吮 梯度平板选育高效转化5一节基海因突变株的研究。 1 材料与方法 1.1 t}发菌株:恶哭很单胞菌PseudomonasPutidaJS-01，南京工业大学制药与生命科学学院菌 种室提供。 1.2培养基及培养条件 保藏培养基:肉汤培养基，3290培养24hro 种子培养基:葡萄搪:1.5%a，玉米浆:1.5%，蛋白陈:0.5%，牛肉膏:0.15%MgSO, 0.025%，NaCl:0.3%，KH2P0,:0.2%，pH7.2,329C培养16hra 发酵培养基:葡萄糖:2%，玉米浆:2.5%,MgSO,:0.025%,NaCl:0.3%,K氏P04: 0.2%抓化钻适量，诱导剂1:0.15%，诱导剂2:0.02%,32℃培养24hr. 1.3 紫外线及5一氛尿喃吮 (5一FU)的复合处理 新鲜斜面菌种接种于肉汤摇瓶，3290培养24hr，以l0%的接种量转接于肉汤摇瓶，329C培养 至对数生长前期，逐步稀释成单菌悬液。分别吸取0.3.1涂布于肉汤平板，用紫外线照射。，5, 10,20,30,40,60秒。功率2OW，距离25cmo黑布包裹避光情况下置培养箱培养。挑选生长 较好的单菌落，分别接种于含的选择培养基上，5一FU的浓度依次增为25ug/mL,50ug/mL, 100ug/mL。每批次观察菌落形态，随机镜检菌种保留生长较好菌种，进行突变株筛选。 1.4 突变株筛选 诱变后分离出的单菌落传代于斜面培养基上扩大培养，再分别接人种子培养基及发酵培养 基培养，离心取菌泥转化底物5-节基海因，389C,120rpm转化24hr，毛细管电泳测定D一苯丙 氨酸含量。 1.5 生物蚤测定:以其稀释25倍640nm处的光吸收值间接表示。 1.6 D一苯丙氛酸的含责浏定:高压毛细管电泳法，详见文献 [6] 2 结果与分析 103 2.1 恶奥很单胞菌JS-01的生长曲线 菌体生长A.值测定结果 (图1)表明，恶臭假单胞菌在培养8hr后进人对数期，16hr后进 人稳定期。 2.2 恶廷很单胞菌JS-01的萦外杀菌曲线 10000 8000 8000 口 知 0 活 a 0 2 喊 4000 ﹂ Q 0 1 000