2012.3本科生生物化学实验电泳技术原理.ppt

* * 电泳原理与技术 移动界面电泳(moving boundary electrophoresis) 区带电泳(zone electrophoresis) 稳态电泳(steady state electrophoresis) 其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。 依据技术原理，电泳可分三种形式: 任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，在一定温度、pH条件下、稳定的静电场中实现对样品中蛋白质的分离，进而进行分析。 ?电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。 常见凝胶电泳的支持介质： ?聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG)由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成。未交链的单体丙烯酰胺属神经性毒素，并具有致癌作用，实验过程注意尽可能避免中毒。实验过程简单，仪器设备叫贵重，但分辨率很高，重复性强。主要用于蛋白质、酶、小分子核酸等分离分析。 ?琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水?-D吡喃半乳糖交替形成。试剂昂贵，方法简单，分辨率较高。主要用于DNA分离分析。 ?淀粉凝胶：1～5%淀粉凝胶作为载体可对一定分子量的蛋白质进行有效分离。成本低，简单。主要用于同工酶等分离分析。 一、醋酸纤维薄膜电泳 1.操作技术要领： (1).醋酸纤维薄膜前处理 (2).点样：点样2～3?l；点样量多少直接影响分离效果，控制点样量是试验成功的关键。点样位置合理：距离薄膜一端约2cm样线上平行点样，2～3个样点基本保持在一条线上。 商品薄膜在pH8.6巴比妥缓冲液浸泡1h以上。取出后，小块滤纸对折吸取薄膜表面多余的缓冲液，进行点样。 (3).醋酸纤维薄膜置于电泳槽 样点一端贴阴极盐桥(黑线端)，非点样端置于阳极盐桥(红线) 排除气泡压实(确保薄膜与电极接触良好)。 (4).电泳：80～100V；35～50min。 pH8.6巴比妥缓冲液 培养皿 醋酸纤维薄膜 - + 点样线悬空切勿接触(近)滤纸 (5).染色 薄膜浸泡于氨基黑溶液中5～10min。 (6).脱色 薄膜浸泡于漂洗液中进行漂洗，至背景为乳白色。 (7).薄膜干燥 (8).透明 薄膜浸泡于透明液中10～30s，及时取出贴于干净玻板上，排气泡。慢加热，逐步烘干。 (9).分析 薄膜从玻板上取下，进行分析。 Alb(清蛋白) ?-球蛋白 ?-球蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 薄膜置于烘箱完全干燥。 - + Alb(白蛋白) ?-球蛋白 ?-球蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 各组分构成 白蛋白 ?1-酸性糖蛋白；?1-抗胰蛋白酶； HP；CP；?-巨球蛋白；脂蛋白； 转铁蛋白；补体系统；β脂蛋白 IgG；IgM；IgA；IgD；IgE? 正常参考值 Alb：57%～68% ?1：1.0%～5.7% ?2：4.9%～11.2% β：7%～13% ?：9.8%～18.2% 凝胶成像系统拍照及扫描分析结果 2.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白质原理 相对分子量(KD) 等电点 蛋白质名称 Alb(白蛋白) ?-球蛋白 ?-球蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 4.64 5.06 5.06 5.12 6.85～7.3 69 200 300 90～150 156～950 - + 在pH8.6条件下血清中哪种蛋白质在电场中向阳极移动最快？ - - - - - - - - - - - - - 分子量相同时，带负电荷越多者移动较快；相同等电点时，分子量较小者向异极移动较快。 ?1比?2球蛋白分子量小，向阳极移动快！ Alb(白蛋白) ?-球蛋白 ?-球蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 - + % 57-72 2-5 4-9 6-12 12-20 polyacrylamide gel electrophoresis 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 不同蛋白质由于带电性质、分子颗粒大小及形状不同，在聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中，向异极泳动速度快慢不同，经过电泳最终被分开。由于蛋白质在凝胶系统分离过程中存在浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，因此，PAGE法是分离、分析蛋白质较好的技术方法之一。 （一）PAGE技术流程简介 2.制胶 1.组架 3.点样 4.电泳 5.染色 6.脱色 7.分析 玻板 胶条 U型玻板 封胶 分离胶溶液 浓缩胶溶液 插入梳子 + - 电极缓冲液 电极缓冲液 通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。其结果是液态转变