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甲壳动物胚胎发育学研究的方法 孟凡丽 陈立侨赵云龙 (华东师范大学生物学系，上海200062) 摘要 甲壳动物胚胎发育学研究已有一百多年的历史．随着生命科学技术及相关学抖的发展， 其研究方法也在不断地完善．本文阐述了从早期简单的外形观察到现代分子生物学技术在甲壳动 物胚胎发育学研究中的应用，总结了各种方法的优点与不足，并探讨了今后的主要发展方向。 关键词甲壳动物胚胎发育研究方法 甲壳动物胚胎发育学研究始于19世纪中期，研究的前期所做工作比较多。Anderson (1982)将其分为两个时期：甲壳动物胚胎学的经典时期(1868～1920)；及甲壳动物胚胎学 的发展时期(1920年以后)。前期研究方法相对简单，技术水平低。主要是以形态观察的方法研 究胚胎发育的过程，因而对胚胎发育的机理认识不足，看法不一。20世纪20年代后，石蜡切片 技术的发展及它在甲壳动物胚胎发育研究中的应用，促进了对其研究的深入。之后的很长一段 时间内，该领域在实验技术上没有大的突破．多数工作只是对传统实验方法的改进和完善。直 到80年代末，才有学者将扫描电镜技术及生化技术引进到甲壳动物胚胎发育学中来，使得甲 壳动物胚胎发育的研究进入了一个新的阶段。但相对于生命科学在基础理论和技术方法上所 取得的日新月异的变化而言，甲壳动物胚胎发育学的研究方法仍处于十分落后的状态。本文拟 就甲壳动物胚胎发育学研究中常规方法的应用作一简单的介绍。 1外形观察 甲壳动物多为体外受精，且有许多种类的受精卵需附着在母体腹部的附肢刚毛上完成孵 化过程，这就为观察其形态发育提供了方便。早期甲壳动物胚胎发育的研究便主要集中于取材 (Decapods)中含有大型卵的种类。借助于早期的显微镜技术，初步了解了部分甲壳动物发育 过程中的外部形态特征，为甲壳动物胚胎发育学的研究奠定了基础。1888年，Reichenbach将 徒手切片法用于研究甲壳动物的胚胎发育，至此，甲壳动物胚胎发育的研究开始由外部形态 的粗略观察转入内部结构的细致描述。 2石蜡切片技术 组织切片技术根据包埋剂的不同可分为3类：火棉胶切片技术、冰冻切片技术和石蜡切片 技术。火棉胶切片法适用于大块组织及硬度较高的组织(如骨、肌腱等)，其切片较厚，一般 在10pm以上，且不能制作连续切片。冰冻切片虽然方法简单，组织不经脱水、透明、包埋等 处理即可切片，但也不能制作连续切片，厚度也较大。1869年，Klebs发明了石蜡切片技术，它 具有切片薄(可达1pm)、可制作连续切片、染色清晰等优点，因而在甲壳动物胚胎发育及其 1060 他多个研究领域中都得到了广泛的应用。 组织切片技术引入甲壳动物胚胎发育学的研究，始于zo世纪20年代。首先是cannon (1 后的胚胎学研究具有指导作用。在这之后的十多年中，甲壳动物胚胎发育的研究工作发展迅 B0nde(1936)研究了赖氏岩龙 察了普氏寄居蟹(E印口舭雕5户一dP4“矗i)的胚胎发育；Von 虾(J。m5 (1 1936)对一种狭腹鱼虱(儿砷吲fⅣ口户“肼砒)的胚胎发育及胚后发育过程进行了研究。软 甲亚纲(MaIacostraca)中，Von 如ommm)的复眼的发生时．提出了视网膜细胞、神经细胞形成的结构模式。石蜡切片技术的 应用，对甲壳动物胚胎发育学的研究起了极大的推动作用，使其研究不再局限于外部结构的 观察，而是深入到内部形态的发生及精细结构。同时这些成果的取得也为后人进一步展开甲壳 动物的胚胎发育研究，探讨发育的机理奠定了基础。 尽管石蜡切片技术具有很多优点，但同时也具有它自身难以克服的缺点。首先，在石蜡切 片的制作过程中需多次用到苯类，尤其是二甲苯。这不仅会使材料松脆，影响实验效果．而且 此类药品多为有毒物质．对人体具有致癌作用，危害极大。其有效代用品又因为价格昂贵，限 制了一些实验室的选用。国内有人做过这方面的改进实验，试图用松油醇来替代苯类．虽然实 验效果不错，但因过程比较复杂，没有得到推广和应用。同时，由于甲壳动物的卵为多卵黄． 卵膜也比较厚，因而药品和石蜡很难将其完全浸透，这也为制作石蜡连续切片带来了一些困 难。其次，随着研究的深入，传统的石蜡切片技术在分辨率上已经越来越难以满足现代组织学 对结构高精细度了解的要求。 3电子显微镜技术 1931年，Ruska和Knoll研制成功了第一台电子