对250例人乳头瘤病毒阳性标本相对定量值和绝对定量值的比较.pdfVIP

对250例人乳头瘤病毒阳性标本相对定量值与 绝对定量值的比较 刘忠1，李小艳1，李银太2 经过近20年对宫颈癌病因学的大量研究结果表明，持续性感染人乳头瘤病毒(humanpapillomavims HPV)是导致宫颈癌的必然因素。但是，研究人乳头瘤病毒时，由于所取标本为宫颈分泌物，难以确定 取样量的多少，目前对研究人乳头瘤病毒负荷量方面的研究报道不多。 本试验采用双色荧光实时定量PCR方法，对年龄在20～56岁之间的250例门诊人乳头瘤病毒检测为阳 性的妇女宫颈取样标本进行了HPV分型及病毒负荷载量的研究。采用B一球蛋白为内标，对所有标本 进行13一球蛋白检测，均显示为阳性。p一球蛋白为宫颈上皮细胞的管家基因，通过统一各标本B一球 蛋白的含量，对标本进行绝对定量。根据病毒负荷载量的定量数量级，我们计算了在这250例阳性标本 中，感染HPV病毒各个数量级的患者量的百分比。 02 通过对各个定量值数量级的病例数分析发现，就相对定量值而言，患者多集中在104—107拷贝之间，l 围，患者量的分布近似于正态分布，104～106拷贝范围处于峰值区域。由此判断，绝对定量值更能真实 地、准确地反映标本所含的病毒量。 本试验通过对病毒载量相对定量值和绝对定量值的研究，为临床提供了对HPV进行定量分析的方法。 使医生能够更准确的判断患者的病情，以及治疗的效果。 近年来，很多研究都显示高危型人乳头瘤病毒(human 素，特别是同一种病毒的持续性感染，更易导致患宫颈癌‘1-3)OHPV的持续性感染，使女|生患宫颈癌的 几率增大，而一直持续高的病毒载量，更易患宫颈癌(4-6o由此可见，对这些HPV病毒进行定量研究， 为预防宫颈癌的发生起到很重要的作用。由于研究人乳头瘤病毒所取的标本为宫颈分泌物，难以确定取 样量的多少，所以，目前对研究人乳头瘤病毒负荷载量方面的研究报道不多，而且，很多都是关于病毒 相对定量的研究，对病毒载量绝对定量的相关报道很少。 13一球蛋白基因作为人类上皮细胞的管家基因，在上皮细胞中的量是基本恒定的，所以很多关于宫 颈疾病方面的研究，特别是涉及到宫颈上皮细胞所含病毒载量的研究，都提出把B一球蛋白基因作为判 断所检测的标本是否含有宫颈上皮细胞的标准或内对照(7-9 o 对患者进行HPV定量时，因为所取的标本为宫颈分泌物，无法确定所含宫颈脱落细胞 的量，所以不能对其进行准确定量；通过检测上皮细胞的管家基因一一B一球蛋白基因 l作者所在单位：诊断医学研究所(香港)johnliu@prexact．corn 2作者所在单位：军事医学科学院野战输血研究所 的量，就可以确定脱落细胞的量，从而能对所取标本进行精确的定量。在对标本所含的HPV病毒扩增的 同时，也扩增该标本的13一球蛋白基因，然后根据当次试验的标准曲线，就可以准确的确定标本所含HPV 的病毒载量。 本研究采用实时荧光定量PCR法，对250例阳性妇科门诊病例进行病毒载量的研究，通过引入B 一球蛋白作为内标，得出这些标本的绝对定量值，对她们进行更精确的定量。 1．材料与方法 1．1材料 1．1．1标本来源 本次试验采用250例宫颈标本，是在2005年到2007年期间收集的。这些标本均为门诊标本，年龄 在20—56岁之间。 所有标本均采用宫颈刷或棉拭收集。临床医师将宫颈刷或消毒棉拭置于宫颈口处逆时针转三圈， 停留十秒，然后置于细胞保存液中(棉拭标本置于生理盐水中)，贮存于2—8。C约一周时间，开始提取 DNA。 1．1．2仪器和试剂ABI 7500荧光定量PCR扩增仪(美国)，荧光定量试剂由意大利ABAnalitica公司提 供。 1．2方法 1．2．1DNA提取 所有的宫颈刷标本和棉拭标本都采用DNA快速提取液进行HPV病毒DNA的提取。具体方法如 下(以棉拭标本为例)： (1)从2-8 c12冰箱层取出待测样本，于振荡器上轻微振荡，将标本混匀后，取1ML到另一离心 管中； (2)加入等体积提取液1，13000