重组肝素酶Ⅰ制备肝素寡糖与其热稳定性的研究.pdfVIP

中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集2005 重组肝素酶工制备肝素寡糖及其热稳定性的研究 况莹，陈银，叶逢春，罗明芳，邢新会， 清〔华大学化学工程系生物化工研究所北京 100084) 肝素 (Mw3000-37000D,平均分子量Mr14000D)作为抗凝剂和抗血栓药已在 临床上应用60多年了，此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等作用。但 是大量的使用肝素常伴有严重的出血副作用，因此在一定程度上限制了其临床应用。低 分子肝素 (LMWH)(Mw3000-8000D，平均分子量Mr5000D)具有与高分子肝素同 样的抗Xa因子 (FXa)作用，而抗凝血酶 (FIIa)活性大大降低，表现出抗血栓形成时 对凝血系统影响小，因而在临床中得到广泛的应用1【]。与高分子肝素相比，LMWH还 具有分子小，易吸收，生物利用度高，体内半衰期长等特点。目前，制备低分子肝素的 方法主要有化学裂解法[[2,3]和酶降解法[[4]。虽然化学裂解法工艺流程较简单，但裂解 过程中加入的强氧化剂会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，此外这 种方法还可能引入毒物而污染环境，而酶降解法由于其温和的反应条件且无毒性易实现 生产连续化而越来越得到人们的关注。目前，酶降解法中主要研究采用来自肝素黄杆菌 (Flavobacteriwnheparinwn)[5]的肝素酶I来制备低分子肝素，因其产量低、纯化困难， 造成酶的成本非常昂贵，限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶 I是一条极有前景的途径，但通常的表达体产生的肝素酶I容易形成包涵体，无法直接 利用。 为确立高效的生产肝素酶I技术，我们利用融合蛋白技术构建了高效生产可溶性的 肝素酶I的基因工程菌株 [6]，目前摇瓶培养的酶活可以达到16000IU/L。由于肝素酶的 融合蛋白具有亲和吸附功能，只需要一步亲和层析就能达到纯度为 95%左右的酶纯化 效果。同时利用融合蛋白的亲和吸附能力容易实现肝素酶I的定向固定化，使开发高效 肝素酶反应器成为可能。本论文通过实验证明融合肝素酶I能够和商品酶一样有效的降 解肝素，制备出理想的LMWH。通过控制酶解反应，得到了一系列分子量分布范围窄 的低分子量肝素 (平均分子量在 5000-6000)。此外，针对肝素酶容易失活的特性，研 究了融合肝素酶I的热失活机理，其的失活遵循三级失活动力学，表明在受热情况下， 该酶的失活主要是由于分子的伸展并形成聚集体而导致的。通过添加外加试剂的方法来 提高该酶热稳定性的实验表明，一些糖类 如〔海藻糖、蔗糖)能够提高融合蛋白的热稳 定性.其中30%的海藻糖能使其半衰期提高7倍多。这一系列的研究为利用重组肝素 酶I制备低分子量肝素的工艺奠定了技术基础。 关键词:肝紊、低分子量肝素、融合肝素酶I.热稳定性 ’通讯联系人:E.mail:xhxing@mail.tsinghua.edu.cn 电话:01062773004;传真:010 290 中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集-2005 致谢 本研究由自然科学基金重点项目(支持。 参考文献 lackHirsh,TheodoreE.Warkentin,StephentiShaughnessyetal.HeparinandLow-Molecular-Weight Heparin:MechanismsofAction,Pharmacokinetics,Dosing,Monitoring,Efficacy,andSafety.Sixth ACCPConsensusConferenceonAntithromboticTherapy. 张万忠，王云山，马润宇，舒志国，肝素降解和低分子量肝素的制备 中国生化药物杂志.2001,22(I): 48-51: BianchiniP，美国专利 US4981955. NielsenJ1.，美国专利 US5106734. Sasisekharan,R.,Bulmer,M.,Moremen,K.W,Cooney,C几andLanger,R.Cloningandexpressionof heparinaseIgenerf