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355 养猪生产与猪病防治专题 o T030032 利用反向遗传技术构建PRRSV基因工程标记疫苗及其初步应用 徐彦召 周艳君姜一峰童 武朱建平童光志 (中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241) 引言 and reproductive syndromevirus，PRRSV)非结构蛋白 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine respiratory 2(Nonstructural protein2，Nsp2)含有病毒复制非必须区域及半胱氨酸蛋白酶活性域…。 方法 为了研究外源基因在PRRSV 台的基础卜【2 (Newcastledisease 分别构建了两个含PRRSV marker(MLu 病毒的IFA检测、序#tJ翘!tl定、以及引入gene I限制性酶切位点)的鉴定等，证实我们成 25+NP49。 功拯救／出Nsp2基因缺失的克隆毒株dHN4一△25和Nsp2基因霞组NP49的克隆毒株rHN4一A 结果与讨论 对救获的两株病毒分别进行了多步生长曲线的绘制和形成蚀斑的测定，结果显示两株克隆毒株与其 列以及在该缺失序列中插入外源基因NP49并不影响病毒在Marc．145细胞上的复制和传代。为了确定引 并分别对其中的P5、P10、P15和P20代等不同代次的病毒进行基因序列测定，结果显示该基因在克隆 毒株的连续传代过程中没有发生缺失、突变等现象，在体外传代具有稳定遗传性。为了进一步在本动物 体内评价克隆毒株rHN4一A25+NP49的免疫效力及引入外源基因的表达水平，我们利用该克隆毒株对猪 体进行了免疫实验，试验结果表明，该重组克隆毒株免疫后，试验猪能够抵抗PRRSV强毒株HuN4株 的攻击，与其亲本疫苗株HuN4一F112的免疫保护效果基本一致，但与之不同的是，对于免疫重组克隆毒 株rHN4．A NP49肽段的特异性抗体，而亲本疫苗毒免疫组则不能检测到该抗体。通过上述研究，我们认为，在PRRSV Nsp2基因内部缺失一定区域，不会影响病毒的生长特性，同时在一定范围内引入适当大小的外源基因 可以使之获得稳定遗传和表达。同时本研究为今后研制PRRSV基因工程标记疫苗奠定了基础。 参考文献 Wassenaar A．E．Thearterivirus unusual with [1l E…J A．L．，SpaanW．J．，Gorbalenya Nsp2 cysteineprotease Snijder protease．An structuresimilaritiestoboth and Biol primary papain—likechymotrypsin—likeproteases．J 【2】张善瑞．高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征病毒及其弱毒株感染性克隆的构建和应用[DI．北京，中国农业科学院博士学 位论文，2010．