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多年生和无性繁殖作物种质资源共享研究 板栗的分子标记研究概况 苑克俊刘庆忠 (山东省果树研究所山东泰安271000) 摘要：目前板栗研究中开发的主要是RAPD标记，也有板栗AFLP标记的 研究报道。本文概述了板栗的DNA提取方法、RAPD标记反应体系、遗传多样 性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种等方面的研究进展，提出了在板栗研究中 应注意应用其他的植物分子标记技术，例如SCAR、SSR、CAPS以及新型的 SNP等。 关键词：板栗；DNA；分子标记；RAPD 板栗是一个重要的经济树种，栽培历史悠久，资源丰富。近年来，在板栗的遗传多样 性分析、品种鉴别等各个方面已逐步应用分子生物学技术，开展了分子标记与分子标记辅 助育种等方面的研究工作。 一、RAPD标记 (一)用于板栗RAPD标记开发的DNA提取 DNA的提取是进行分子生物学研究的基础。由于幼嫩组织DNA含量高，次生物质 少，一般选取植物的嫩叶组织提取DNA。板栗营养组织中由于酚类化合物和单宁等次生 物质含量高，DNA提取和纯化非常困难[1]。 沈永宝等的研究结果表明，提取时加6o／off一巯基乙醇的CrAB方法可较容易地提取板 栗冬芽、嫩叶、半木质化韧皮部和老枝韧皮部的DNA，且DNA的纯度较高，其A2m／ A2s。值高于1．8，可满足分子标记实验的要求；对于成熟叶片，则DNA的纯度较低，且 带有褐色，但经过两次酚抽提后A2eo／Am值也达到1．7以上[2]。他们认为，板栗叶片中 酚含量高，保温时极易氧化，是导致DNA提取失败的主要原因。在提取液中必须加大抗 氧化的口—巯基乙醇用量。CTAB和SDS方法提取DNA的效果差别不大。 项艳等通过对板栗基因组DNA几种提取方法获得的DNA质量分析，则认为在提取 最为理想的提取方法，能满足RAPD及其他分子生物学研究的需要口]。他们用高盐低pH ·200· 板栗的分子标记研究概况 为，通过调节提取液的渗透势，使之与细胞核内的渗透势保持平衡，可防止细胞核破裂。 在细胞核裂解前，在提取液中加入2％PVP可将细胞质中的酚类等杂质与细胞核分开、排 除污染。加入2．5％芦—巯基乙醇的提取介质，可有效防止氧化褐变，所提取的DNA絮状 沉淀颜色最白、最易溶解。翁尧富等的研究也表明，在CTAB方法的提取液中加入1％ PVP效果理想‘“。 综上所述，对于含酚类物质较高的板栗组织采用CTAB或SDS方法提取DNA时， 宜加大抗氧化的芦—巯基乙醇用量或如人1％～z％的PVP。同时加入2％PVP和2．5％口一 巯基乙醇能有效地抑制多酚类物质氧化，排除多酚类等杂质干扰，获得纯度较高的基因 组DNA。 项艳等还认为，在DNA提取过程中，单宁、多糖等物质与DNA结合成非常黏稠的 胶状物质，用异丙醇沉淀DNA后，4℃条件下离心很难去除这些物质，只有在20℃左右的 温度条件下离心才能有效去除，由于操作过程的温度为室温条件，容易导致DNA降解。 因此，操作过程中动作既要轻又要快o]。另外，由于在乙醇的盐溶液中DNA沉淀的速度 远远大于色素和多糖等其他物质，在加人乙酸钠和无水乙醇时，DNA沉淀出现后将其立 即分离，这样可进一步排除多糖、色素等其他杂质[3]。 (二)板栗RAPD标记的反应体系 目前在板栗的分子生物学研究中RAPD技术的应用较多。RAPD技术应用中的一个 主要问题是重现性差，实验结果容易受到多种因素的影响。因此，建立可重复的RAPD反 应体系对确保实验结果的准确性至关重要。对板票不同品种进行RAPD分析，首先应建立 稳定的反应体系，这样才能将RAPD谱带用于品种间遗传差异比较。项艳等通过实验确定 dNTP、3U DNA聚合酶、2．0mmol／L 物、180／zmol／L Taq MgClz。反应扩增程序为： 尧富等、高捍东等经过大量的实验，也各自确定了一个较为理想的2毗l板栗RAPD反应 体系‘6，7l。 (三)RAPD标记在品种鉴定、遗传多样性和种间亲缘关系分析中的应用 传统的板栗品种划分方法