永生化人肝细胞系的建立与生物学特性研究.pdfVIP

【摘要】 retrovirus， 目的：建立稳定抑制猪内源性逆转录病毒(porcineendogenous PERV)表达且不含PERV-C的猪成纤维细胞，为下一步培育更安全的转基因猪提供核供体 细胞，从而解除异种器官和细胞在异种移植和生物人工肝应用中的PERV感染的风险。方法： 选择具有PERV低拷贝数且不含PERV-C的西藏小型猪，获取其成纤维细胞；再利用RNA 即，2，p013)和2对阴性对照(negative timeRT-PCR、Westernblot 转染稳定表达PERV的HEK293细胞，利用Real analysis和细胞 免疫化学评价PERV在mRNA和蛋白水平的表达情况，筛选出能够抑制PERV表达最为有 效的short hairpin 作为shRNA的表达载体系统。将该片段导入西藏小型猪成纤维细胞，抑制该细胞中PERV 表达，建立稳定表达shRNA的猪成纤维细胞，并再次验证PERV在该细胞中mRNA和蛋白 水平的表达情况。结果： 我们发现shRNA-pol3是抑制PERV表达最为有效的片段；获得 稳定表达shRNA-pol3的西藏小型猪成纤维细胞与猪胚肾细胞株PKl5和野生型的西藏小型 猪成纤维细胞相比，PERVmRNA表达量仅约10％，PERVP15E蛋白表达也显著下降。结 论：本研究获得的稳定表达shRNA的西藏小型猪成纤维细胞具有较前更低的PERV拷贝数， 且没有PERV-A／C感染的风险，可以作为下一步培育更为安全的稳定表达shRNA的转基因 猪的核供体细胞。 【关键词】RNA干扰；猪内源性逆转录病毒；抑制性表达；西藏小型猪；成纤维细胞 永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究 2南方医科大学再生医学研究所510282 1南方医科大学珠江医院肝胆二科5102822 李治国1吴青松1刘广波1潘明新1葛梅1杜江2汪艳k2高毅1’2 【摘要】目的：构建永生化人肝细胞系，并对其生物学特性及某些功能进行研究，评 价其作为生物人工肝种子细胞的可行性。方法： 利用慢病毒表达载体对原代培养的正常人 永生化人肝细胞系HepGL。以噻唑蓝法测定其生长曲线，并分析其染色体核型；RT-PCR测 287 定其相关功能基因和表面标志基因表达；蛋白印记法和免疫细胞化学检测肝功能相关蛋白表 达；酶联免疫法检测其白蛋白和尿素合成功能。裸鼠皮肤接种和软琼脂克隆试验观察细胞致 瘤性。结果；所建立的永生化人肝细胞HcpGL具有原代肝细胞的典型形态特征，而且具有 较好的增殖能力，细胞倍增时间为36小时。染色体核型分析表明细胞核型无明显异常； 8 3A4，ASGPKGS，GSl机HBCF-X，HNF4，CKl RT-PCR检测HepGL可以表达ALB，P450 mRNA：蛋白印记法测定ALB表达与原代肝细胞相当；免疫细胞化学检测ALB阳性表达显 能生长；裸鼠皮肤接种部位及各脏器均未见有肿瘤形成。结论。本研究建立的永生化人肝细 胞系HepGL具有与原代肝细胞类似的形态特征和生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细 胞移植研究中理想的种子细胞材料。 【关键词】永生化：肝细胞：生物学特性：肝细胞系；H．TERT 线形曲线超滤在血液透析相关性低血压的应用及护理体会 山东大学第二医院血液净化科厉淑荣肖合存王会邵倩 【摘要l目的：血液透析相关性低血压是指血液透析时，患者收缩压降低20mmHg或 更多，伴或不伴低血压的症状。血液透析相关性低血压可导致透析血流量不足，超滤困难， 透析不充分，诱发心律失常、心绞痛，肾脏血流量不足及残余肾功能进一步下降，甚至死亡 等，是影响血液透析质量的首要因素。观察线形曲线超滤在血液透析相关性低血压的应用与 效果，为无症状透析探索一条常规治疗方案。方法s通过对15例维持性血液透析易发生低 血压的患者采用线形超滤曲线，根据以往透析中血压变化特点、