人类神经前体细胞大鼠胎脑内移植的研究.pdfVIP

首届中国中青年神经外科医师论坛论文汇编 基础与交叉学科 无少突胶质细胞产生。结论脐带组织来源的基质细胞可以表达神经细胞的标志物，在体外能够分化为 形态复杂的神经元样细胞，这种细胞有可能成为神经移植的种子细胞。 人类神经前体细胞大鼠胎脑内移植研究 广东省潮州市中心医院神经外科(潮州，521021) 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所(上海，20000) 扬立业 郑佳坤 郭礼和 广东省自然科学基金资助(012452，020001) 神经干细胞是功能上未成熟的、多能的和能自我更新的细胞，能通过非对称分裂产生自身以外的细 胞…。传统的观点认为，中枢神经系统内仅在发育阶段存在神经千细胞，当神经元终末分化后，成年脑便 失去了再生的能力。然而目前有研究表明，脑中轴结构，包括丘脑、脑室下区、嗅球和海马的齿状回在胚 胎期和成年后仍存在神经干细胞”。1。它们在中枢神经系统的作用及其神经修复的潜能现在还不明了。 有研究者巳成功地从胚胎和成人的脑组织中分离出神经干细胞，这些细胞培养在表面未处理的塑料培养 fibroblast growthfactor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicgrowth 皿中，在表皮生长因子(epidermal factor，bFCF)的刺激下可以增殖。当这些细胞种植在经粘连因子处理过的培养皿中，这些细胞可随机分 化为神经元和胶质细胞u一-。本文报告人类神经千细胞的体外分离培养条件、扩增和外源基因的表达，研 究人类神经干细胞移植到胚胎大鼠的脑室后细胞的移行和分布，为开展细胞和基因治疗抻经系统疾病奠 定基础。 材料和方法 材料 白、胰岛索、硒化钠、腐胺、转铁蛋白、肝素、多聚鸟氨酸、孕激素、表皮生长因子(EGF)、5-溴脱氧尿嘧啶核 品；抗体来源于以下的公司：鼠抗?Ⅲ管蛋白单克隆抗体(1：400)和鼠抗半乳糖脑苷脂单克隆抗体(1： 酸荧光素结合的纯化的第二抗体来源于Chemicon(1：100)；ABC试剂盒为博士德公司产品。 细胞培养条件 取胎龄为7—10周的选择性流产的胎儿，切取脑组织，去除硬脑膜，将大随皮质移到直径为3．5cm Carpenter 首届中国中青年神经外科医师论坛论文忙编 基础与交叉学科 械分离神经球的细胞，用N2培养基嚣悬，离心去上清，加入N2培养基、bFGF和EGF，种植到培养缸中培 养。细胞可用含10％二甲基亚砜的N2培养基在液氮中冻存。在37。C快速复苏，离心去除二甲基亚砜． 加入N2培养基、bFGF和EGF，种植到培养皿中培养。 腺病毒转染 染复数感染293细胞，收集上清，按Hitt[61的方法纯化高纯度的病毒。指数生长的神经细胞种植在经层 对细胞进行感染。48h后，细胞用0．05％的戊二醛／磷酸盐缓冲液固定12 mir，磷酸盐缓冲液洗3次，用 x·gal染液(15raMK2Fe(CN)6，15mM K3Fe(CN)6，1．5raM Mgcl2，1mg／mlX—gal)对细胞进行染色，过夜， 磷酸盐缓冲液洗两次，Ad5pgal感染的阳性细胞表达139al活性，可在显微镜下观察，照相。在移植前，细 移植用。 免疫细胞化学染色 机械分离神经球的细胞(第3代)，种植在多聚鸟氨酸和层粘连蛋白处理的培养皿中，贴壁48h后，检 查巢蛋白和波形蛋白的表达。对于分化研究，分离的细胞种植在含有N2／2％FBS培养基的培养皿中，细 抗体孵育过夜，冲洗后，与异硫氰酸荧光素标记的第二抗体在室温下孵育1．5h。反应产物在荧光显微镜 下观察(Nikon，Japan)。ABC免疫细胞化学染色方法按试剂说明书的方法进行。 BrdU标记 第三代细胞培养3d，换培养基，1d后将细胞移至经多聚鸟氨酸和层粘连蛋白处理的24孔培养板中， 鼠二抗，以后的步骤按常规进行，在荧光显微镜下观察。待