橡胶树总RNA与基因组DNA的同步分离.pdfVIP

橡胶树总RNA和基因组DNA的同步分离 王其同，曾霞，安泽伟，孙芳，李玉婷，黄华孙 国家橡胶树育种中心，中国热带农业科学院橡胶研究所，儋州，571737． 摘要植物分子生物学研究需要制备高质量的核酸，针对不同植物的特点研究人员开发了相应的核酸提取方法。本 530．2Il 获得高质量的总RNA和基因组DNA，且二者的得率较高，RNA为2280．6u晚样品鲜重，DNA为l e-／g 样品鲜。RT-PCR和DNA酶切反应表明，本研究所分离的RNA和DNA完全能达到分子生物学实验的要求。同时， 用该方法对水稻和大豆叶片进行了总RNA和基因组DNA的分离，得到的RNA和DNA均能达到分子生物学实验 要求，说明该方法具有一定的通用性。 关键词橡胶树；聚乙二醇(PolyethyleneGlycol，PEG)；核酸提取：RNA；DNA 核酸是分子生物学研究的主要对象，获得高质量的总RNA和基因组DNA对开展分子生物学研 究至关重要，然而没有一种方法能适用于所有生物的核酸提取。对于植物基因组DNA的提取，十 法和SDS法等，以及由上述各种方法改良应用于不同植物总RNA提取的方法。然而，无论任何方 法，其最终的沉淀核酸所用试剂都基本相同，即沉淀DNA的异丙醇和无水乙醇等：沉淀RNA的 LiCI、异丙醇、NaAC和无水乙醇等。另外还常用PEG沉淀方法获得质粒、病毒和微生物等的 DNA[1,2,3,4,51。 性沉淀分离不同分子量的DNA分子，较低的PEG浓度有利于高分子量DNA的沉淀；并且分别对 聚合，依据其分子大小来沉淀核酸。由于PEG具有特殊的理化性质，在核酸的纯化实验中具有广泛的应 用前景。本研究对PEG在同时分离纯化橡胶树(Hevea 进行了探讨，旨在建立一种快速、简便地获得高质量橡胶树RNA和DNA的方法。 l材料和方法 1．1植物材料 本研究所用的巴西橡胶树幼嫩叶片取自中国热带农业科学院橡胶研究所种质圃，水稻幼苗叶片，大豆 叶片取自海南大学农学院苗圃。 1．2实验方法 1．2．1主要试剂：2％CTAB提取缓冲液(含2M moFL (w／v)30％PEG8000溶液，8 h 以上备用。 1．2．2实验操作： (1)CTAB法裂解提取总核酸 3-巯基乙醇，混匀65*(2水浴l-2min，冷却后加入5mL水平衡酚和0．5ml氯仿， CTAB提取缓冲液和400I_tl 涡旋，充分混匀，15。C ．119． 12000rpm离心10min。视上清液通透程度，可重复用等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提。 (2)PEG沉淀法分离RNA和DNA DEPC水溶解沉淀，转入洁净1．5mi离心管中， 总RNA分离：沉淀用75％乙醇漂洗两次后，用4009l 加入1／10体积3MNaAc，混匀后加入2．5倍体积的无水乙醇，混匀，．20C放置l-2h，4C 12000rpm离心 10rain，在超净台上风干RNA沉淀后用30p．1DEPC水溶解，．80℃保存备用。 基因组DNA分离：将上清液转入另一新管中加入1／10体积3MNaAc，混匀后加入2．5倍体积的无水 乙醇，充分混匀，一20C放置l一2h，4C ddH20溶解DNA，．20℃保存备用。 干沉淀后用309l 1．3总RNA和基因组DNA质量检测 1．3．1凝胶电泳检测 条带，无DNA污染。 拍照。 1．3．2分光光度计测定分析 取1lal 并计算其比值。 1．3．3RT．PCR 1stStrandeDNA 取299RNA利用PrimeScdptSynthesis 说明书进行。 以eDNA为模板对管家基因Actin和18S进行扩