一步法复合RT-PCR鉴别新城疫强毒和禽流感病毒的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会论文集 一步法复合RT—PCR 鉴别新城疫强毒与禽流感病毒的研究 黄兵1，-，马秀丽1，宋敏训-，王莉莉·，李峰，，陈溥言z (1．山东省农业科学院家禽研究所，山东济南250023； 2．南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫熏点开放实验室，江苏南京210095) 异扩增片段分别为156 bp和219bp，建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT—PCR方法。试验中未 丽NDV弱毒株全为阴性。经验证，复合引物与单一引物的扩增效率一致，将病毒尿囊液稀释至10-s亦能检测到目的 RNA。这些试验结果表明，此次建立的一步法复合RT-PCR特异、敏感，适用于强毒力NDV和AIV感染的快速鉴别。 关键词：新城疫病毒；禽流感病毒；复合RT—PCR；分子鉴别 新城疫(ND)和禽流感(A1)不仅影响我国禽群自行分离鉴定。NDV—F48E8参考强毒株，NDV弱毒 (La 的健康生长，而且因食品卫生安全受到国际贸易的 株 sota)，IBV 频繁限制和封锁，给养禽业造成巨大的经济损失。 新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)都可引起鸡业科学院家禽研究所保存。AⅣ(H5和H9亚型)和 呼吸道、消化道粘膜出血等病症，从临床上很难将 6个NDV弱毒株(从待出口鸡肉中分离)，由青岛出 其区分开。若能在数小时内对ND和Al作出确诊，入境检验检疫局提供。16个NDV强毒株鸡胚尿囊 这将是一项有重大实际意义的工作。RT-PCR已应液，自1997年至2003年问在山东省鸡群中分离， 用于这两种病毒的核酸检测。由于多数鸡群普遍使 由山东省畜牧兽医总站和山东省农业科学院家禽 用NDV弱毒疫苗进行免疫，很有必要将强弱毒株 研究所保存提供。 区分开。一步法RT—PCR和多重PCR技术的发展1．2主要试剂及栽体TrizolRNA提取试荆，购自 使多种RNA病原的检测更加简便，尽可能地减少 了试验污染，大大缩短了检测时间。AIV的血清皿 型很多，但其核蛋白(NP)基因相对保守，具有型特 异性。而融合蛋白(F)是NDV致病的重要因素，F柱式胶回收试剂盒，购自生工生物工程(上海)有限 基因的变化是毒力强弱的分子依据。基于此，根据 公司。Pmdl8-Tvector，购自宝生物】：程f大连)有限 NP和F基因设计复合引物建立起一步法公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。 RT—PCR，既可快速鉴别Arv和NDV感染，又可区1．3病毒增殖取9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔接 分NDV强弱毒株。 种，收集24h一96h的活胚和死胚尿囊液。其中IBV 增殖时间为36 h，IBDV和REOV为鸡胚毒，REV为 1材料和方法 鸡胚成纤维细胞毒。一20℃保存备用。 1．1 材料NDV强毒株(LC、CQ、SX、PY、CY)， I．4模板KNA提取取1．5mL微量离心管，加入 100斗L病毒液和400肛LTrizol，振摇混匀，室温放 min。． 置5min。加入100“L氯仿，振摇，室温放置5 基金项目：山东省科技厅重大公关项目(031020101) 000 于4℃12r／min离心10 作者简介：黄兵(1973．)，男，贵州人，博士研究生，主要从