实验一 分光光度技术.docVIP

实验一 分光光度技术 一．概念 分光光度法（Spectrophotography），又称为比色法，它是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。 有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光的吸收能力不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。 比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。使用的光谱范围200－1000nm 紫外光区：200－400nm 可见光区：400－760nm 红外光区：760－1000nm 二．基本原理 物质的吸收光谱与它们的本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。每种物质都具有特定的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。 分光光度法根据的原理是Lambert－Beer定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。 1. 朗伯（Lambert）定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加而成指数减少，即 I / I0 = e－K1L I0：入射光强度， I：出射光强度， L：介质的厚度 e: 自然对数的底，即2.718 K1: 溶液的吸光率 ln（I0/I）= K1l? 换算成常用对数式，即 令K = 0.4343·则log（I0/I）= Kl 此处以K为吸光率令T =（I/I0）? A = log（I0/I） 则A = KCl A为吸光度，T为透光度?: 已知浓度标准管 A2?: 未知浓度测定管 A1/ A2＝（K1C1L1）/（K2C2L2） 因为使用的比色杯径长相同，即L1＝L2，所以上式可改写为： A1/ A2＝（K1C1）/（K2C2） 又因为标准液和测定液中的溶质为同一物质，所以K值相同，即：K1＝K2 所以上式可改写为 A1/ A2＝C1/C2 所以C2＝（A2/ A1）C1 实验中，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其他的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。 2.标准曲线法 制备一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度 注意事项： ①. 标准曲线是一过原点的直线 ②. 标准曲线范围在被测定物质浓度的一半到两倍之间，并且A（吸光度）在0.05－1.0之间为宜。 ③. 标准曲线仅供短期使用，应在曲线上表明操作仪器，操作者及操作时间 ④. 测定标准曲线及样品需使用同一台仪器 实验中，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白管，即其中除了待测溶质外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。 三．仪器的结构 1．定义：对某一波长的光吸收值（吸光度）进行测定的仪器称为分光光度计。 2. 分类：根据所测光谱范围分为：紫外、可见、红外分光光度计及万用（全波段）分光光度计。 3. 结构组成 ①光源：要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。 常用光源有：钨灯或卤钨灯：工作范围360－1000nm，用于可见光区，近紫外光区和近红外光区 氢灯或氘灯：工作范围150－400nm，可作紫外光分光光度计的光源 ②分光系统（单色器）：把混合光分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，将不同波长的光分开 ③吸收池（比色皿、比色池）：用来盛待测溶液。一般用玻璃、石英制成。 小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外吸收时要用石英比色皿。 ④检测器：光电池、光电管、光电倍增管组成 ⑤测量装置：以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的仪器长附有自动记录器，可自动描出记录曲线。 蛋白质化学实验 一．双缩脲测定蛋白含量 肽键结构 双缩脲结构 1.原理：蛋白分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中与Cu2＋结合形成紫色化合物，此反应称为双缩脲反应，紫色化合物在520nm波长下有最大光吸收。在一定浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，所以可用比色法测定蛋白质含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 2.方法：采用标准曲线法 ①标准曲线制作 （1）取小试管6支，编号，按下表操作 双缩脲法操作步骤表 试剂（mL） 管 号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 － 生理盐水 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 （2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520