重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测.pdfVIP

第３５卷 第２期 暨南大学学报（自然科学与医学版） Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．２ ２０１４年４月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ） Ａｐｒ．　２０１４ 重组人过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达、 纯化和活性检测 １ １ １，２ １，２ 孙　华 ，　张自德 ，　江仁望 ，　王　峰 （暨南大学 １．药学院；２．中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东 广州５１０６３２） ［摘　要］　为了了解人过氧化氢酶在各种常见肿瘤细胞中的表达情况，构建人过氧化氢酶的原核表达载体，在大 肠杆菌中表达、纯化人过氧化氢酶，并进行活性检测．我们通过常规分子克隆手段构建原核表达载体 ｐＥＴ１５ｂ ｈＣＡＴ，将其转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ，经过ＩＰＴＧ诱导，表达产物经超声破碎后用ＮｉＮＴＡ柱进行亲和层析纯化，用 试剂盒检测重组ｈＣＡＴ酶活性，然后检测其对ＤＮＡ氧化损伤的保护作用．通过荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）测定ｈＣＡＴ基 因在ＨＬＦ１正常细胞与几种常见肿瘤细胞中的表达情况．本研究成功构建了ｐＥＴ１５ｂｈＣＡＴ的原核表达载体，ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测结果表明，ＩＰＴＧ诱导表达出一条分子质量约为５９７ｋｕ的目的蛋白，该蛋白主要以可溶的形式存在，活 性检测表明经纯化得到的ｒｈＣＡＴ比活力为６２９Ｕ／ｍｇ，ｐＵＣ１９质粒氧化损伤保护实验显示ｒｈＣＡＴ对ＤＮＡ有一定的 损伤保护作用．ｑＰＣＲ检测显示ｈＣＡＴ基因在Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＰＣ３、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２等肿瘤细胞中的表达量明显 低于ＨＬＦ１正常细胞．成功构建了人过氧化氢酶的原核表达载体，利用大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ获得了ｈＣＡＴ的可溶 性表达，纯化的ｒｈＣＡＴ具有活性，ｈＣＡＴ基因在Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＰＣ３、ＨｅＬａ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２等肿瘤细胞中的表达量明 显低于ＨＬＦ１正常细胞．这为后续功能研究及性质实验奠定了基础． ［关键词］　过氧化氢酶；表达纯化；过氧化氢酶活性；ＤＮＡ损伤保护；荧光定量ＰＣＲ ［中图分类号］　Ｑ７８　　［文献标志码］　Ａ　　［文章编号］　１０００－９９６５（２０１４）０２－０１８６－０６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｏｆｈｕｍａｎｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ １ １ １，２ １，２ ＳＵＮＨｕａ，　ＺＨＡＮＧＺｉｄｅ，　ＪＩＡＮＧＲｅｎｗａｎｇ ，　ＷＡＮＧＦｅｎｇ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ； ２．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃＣｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＴＣＭａｎｄＮｅｗＤｒｕｇｓＲｅｓｅａｒｃｈ， ＪｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３２，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＡＴｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅｈＣＡＴｇｅｎｅ，ａｎｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｈＣＡＴｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ１５ｂｈＣＡＴｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｐＥＴ１５ｂｈＣＡＴ ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａｇａｍｉ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ ＮＴＡｃｏｌｕｍｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｆｔｅｒｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｈＣＡＴｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣａｔａｌａｓｅ ＡｓｓａｙＫｉｔ．ｑＰＣＲｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｈＣＡＴｇｅｎｅｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄ ＨＬＦ１ｎｏｍａｌｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｐＥＴ１５ｂｈＣＡＴｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｒｈＣＡＴｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ，ＳＤＳＰＡＧＥｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｈＣＡＴｗａｓ５９７ｋｕｉｎｓｏｌｕｂｌｅｆｏｒｍ．Ｃａｔａｌａｓｅａｓｓａｙ ［收稿