牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及其初步应用.pdfVIP

第六届理事会第二次会议量教学专业委员会2006年会议论文集 39份，这一实验结果表明经结核菌素检测为阳性的样品，PCR检测结果不一定为阳性，由 于结核菌素检疫易受各种因素的影响，特别是自然界大量的其它分枝杆菌的存在干扰结核病 的检疫，致使其特异性不是很强，甚至有时会有假阳性出现。因此，本方法的建立，可以提 高对牛分枝杆菌的检出率，减少牛结核病的发生以及由动物引起对人类的危害。 参考文献略 牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用★ 亓文宝1，罗满林1，用荣2，白培胜2，贺东生’，刘镇明1，黄毓茂1 (1．华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2．广州市儿童医院，广东广州510120) 摘要：根据分枝杆菌的插入序列ISl081设计引物和探针，建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法． 谈方法的敏感性达到了10个拷贝。且特异性高，重复性好．对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性 的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性；而对PPD检测阳性，巢式PCR检测为阴性的15 份临床样本进行l检测时，2份为阳性；在对2份PPD检测职性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果 也为阳性．本方法对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义． 关键词：牛结核；病荧光定量PCR；快速检测 牛结核病(Bovine bovis)引起的，人 tuberculosis)主要由牛分枝杆菌(Myeobaeterium 和动物的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因，严重危害公共卫生安全。随着牛奶在 人正常饮食中的比重加大，人的结核病发病率也在上升，社会流行病学研究显示，二者星 明显的流行病学相关性111。实践证明，对结核病的防治关键是对牛结核病的防治。然 而，以细胞免疫为主的免疫学机制同样使得结核病不能和其它疫病一样用传统的免疫血清学 方法有效地进行诊断。随着分子生物学技术的迅速发展和对结核病研究的深入。新的诊断方 Quantitive 法不断涌现。本文将荧光定量PCR(FlurescentPCR,FQ-PCR)技术用于牛结核病的 定量检测，通过进行特异性、敏感性、重复性验证，并与PPD试验、巢式PCR方法进行比 较，建立了快速、灵敏、准确地检测牛结核病的方法。 1材料与方法 1．1参考菌株 员惠赠。 1．2主要试剂 TaqDNA聚合酶(5u／gL)、EXTMTaq DL2000 由广州市儿童医院周荣研究员无偿提供。 1．3样品的采集 在广州市动物防疫监督所的大力支持下，采取PPD检测阳性进行淘汰的牛淋巴结、肺 淋巴结、肺等组织样品22份，抗凝血34份，．20℃保存备用。 1．4引物和探针的设计与合成 根据已发表的分枝杆菌复合物的插入序列ISl081的基因序列，应用ABI公司提供的Pr imer express2．0软件设计出用于定量PCR的引物和荧光探针(由上海博亚生物有限公司合 5·．TTCCAAGTCGCAAG 成)，PCR产物长度为56bp，命名为TB．56FQ。上游引物FQF： ．569． 牛羊马传染病 M)·。I’GGCCAAAGAGC’I’C-(TAMRA)。3’。 1．5模板制备 。i 不同来源的样品的DNA的提取见参考文献【2】。 1．6标准品的制备 酶切法对质粒进行鉴定，并进行测序分析。提取阳性质粒，．20C保存备用。 1．7标准品浓度的测定 将阳性质粒作100倍稀释，用分光光度计测定阳性质粒的OD值，并计算其浓度 (Copies／gL)。计算公式如下：拷贝数=质粒浓度×阿氏常数／(一个碱基对的平均分子量×质粒 的总的长度)，其中，阿氏常数为6．02x1023，一个碱基对的平均分子量为648，重组质粒的 总长度为2748bp。 1．8PCR反应条件的探讨 7000型荧光