人TLR4基因5%27正调控区的鉴定.pdfVIP

比值，肺血管通透性，肺组织髓过氧化物酶活性；血浆肌酐和尿N一乙酰氨基葡萄糖苷酶， 第二部分给药方法同第一部分各组，然后测定2给药后小时各组血压水平并观察各组动物 24小时死亡率。 结果 内毒素组出现低氧血症、休克，治疗组血压及血气情况明显恢复，内毒素组肺组 织湿重／干重比值明显增加，与对照组比较，差别显著(po．01)，治疗组明显低于内毒素组 (pO．01)；肺组织髓过氧化物水平内毒素组高于对照组(pO．01)，治疗组则低于内毒素组 内毒素组(n=lO，死亡数4个)死亡率40％，干预组死亡1个，死亡率为12，5％。 结论蛋白酶抑制剂乌司他丁对LPS所致大鼠脓毒痘休克及多脏器功能障碍具保护作 用，降低动物的死亡率。 关键词： 乌司他丁 内毒素 蛋白酶 人TLR4基因5’正调控区的鉴定 冯凯 文爱清 黄宏 朱佩芳王正国 蒋建新 合伤国家重点实验室，第三军医大学大坪医院野战外科研究所／中国人民解放军交通医学研 究所(文爱清、黄宏、朱佩芳、王正国、蒋建新) 【摘要】 目的初步确定TLR4基因5’远端髓系细胞特异性的转录调控区域。方法采用分 子克隆结合报告基因分析的方法，构建TLR4基因5’旁侧一2413～+66序列与荧光素酶报告基 检测各报告基因质粒荧光素酶活性。结果TLR4基因5’旁侧转录起始位点上游一1337～ 细胞特异性的调控区域，定位并鉴定参与调控的转录因子，可望阐明TLR4基因表达调控及其 组织和细胞特异性表达的机制。 【关键词】 内毒素；ToLL样受体4；转录调控 人TLR4基因自1998年成功克隆以来…，大量研究表明，它是介导细菌内毒素 的非特异免疫反应具有重要作用12-5)Q但是迄今关于TLR4基因转录调控的研究，主要集中于 端调控元件的调控，启动子位于转录起始位点之前743bp序列以内，参与基础转录调控的核 心区域位于-75至起始密码子之间”’。他们实验显示，在TLR4基因5’-3228～一743bp之间， 可能存在一个单核细胞特异的远端负调控区，在T}IP—l细胞中特异地抑制荧光素酶报告基因 活性。Roger等对小鼠TLR4基因基本转录调控的研究，也发现了类似的上游调控区域“’。但 到目前为止，TLR4基因5’远端调控区域尚没有更精确的研究。为此，我们采用基因克隆和 报告基因技术，在髓系K562细胞中，对TLR4基因5’远端调控区域进行了进一步的定位。 1．材料、仪器与方法 1．1材料 1．1．1质粒pGL-3一promoter、pRL—CMV购自Promega公司。 1．1．2引物TLR45’区(一2413～+65)克隆用引物由上海生物工程有限公司合成。上游引 5’加上了XhoI酶切位点和三个 物P15’加上了MluI酶切位点和三个保护碱基，下游引物P2 保护碱基，其序列为： 3’ P1：5’tog，acg，cgt，aca，tgg，acc，tgt，gat，gat，tag，g 3’ P2：5’cta，etc，gag，age，aat，tgg，tgt，att，caa,agc，a 1．1．3试剂小量质粒抽提试剂盒，小量胶回收试剂盒为Omega公司产品；PCR反应试剂盒， 光报告分析系统(Dual-LuciferaseReporterAssaySystems)为Promega公司产品。 1．1．4其它人白血病细胞株K562由重庆医科大学检验系提供，JMl09菌株购于Promega公 司。 Ascent luminometer)为芬兰ThermoLabsystems公司产品。 1．3方法 1．3．1各重组载体的构建 采用真核转录调控的基本方法一缺失法，对功能区域进行初步定位。先将TLR4基因5’ 区(-2413 66)克隆到一个无启动予的荧光报告基因的上游，然后根据不同的限制性内切 酶对克隆到荧光报告载体上游的TLR4基因5’区进行缺失，形成含有不同TLR4基因5’区片段 的衍生质粒。 1．3．1．1 pGL-3-TLR4基因5’区(-241366)质粒的构建 pGL3-promoter Bglll限制性内切酶进行双酶切，然后用DNA聚合酶大片段(Klenow)将其粘性