实时荧光定量PCR+检测急性白血病的肝细胞生长因子mRNA+的表达及临床意义.pdfVIP

细胞脱落瓶壁漂浮于培养液中 贴壁生长的细胞明显减少 细胞体积缩小 密度增加 染色质密集 流式细胞学检 查发现 特异性siRNA转染MCF-7细胞后 与对照组相比 细胞的凋亡率增加 所有结果均表明 本研究合成的3对靶向hTERT特异性siRNA 转染MCF-7细胞后 均可有效抑制hTERT 的表达 抑制细胞生长 促进细胞凋亡 这为进一步利用hTERT为靶点进行肿瘤的基因治疗和药物开发打下基础 实时荧光定量PCR 检测急性白血病的 肝细胞生长因子mRNA 的表达及其临床意义 1 2 3 4 岑 东 吕建新 裴仁治 涂植光 余晓林 文阳安 宁波市鄞州人民医院 1 检验科 3 血液科 315040 2 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室 325000 4 重庆医科大学医学检验系 教育部 临床检验诊断学 省部共建重点实验室 肝细胞生长因子 hepatocyte growth factor, HGF 在肿瘤的发生发展 侵袭和转移过程中的促进作用被充分肯 定 对以肿瘤细胞增殖快 直接通过血道转移为特点的血液肿瘤如白血病 淋巴瘤等的作用可能更为显著 但国内 外相关研究报道较少 主要以检测血清HGF 蛋白和定性检测HGF mRNA 为主 且报道的表达情况相差较大 基于 此 我们首次采用实时荧光定量PCR fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR 对急性白血病 acute leukemia, AL 的HGF mRNA 的表达进行了定量测定 以期探讨HGF mRNA 的表达在AL 的意义 病例与方法 一 研究对象 2002 年9 月至2006 年8 月期间以MICM 诊断标准确诊为AL 的67 例未治患者的骨髓标本 男 42 例 女25 例 中位年龄38 3 77 岁 其中 急性髓系白血病 AML 41 例 M0 1 例 M2 6 例 M3 11 例 M 13 例 M 10 例 急性淋巴细胞白血病 ALL 26 例 L 12 例 L 10 例 L 4 例 19 例非白血病骨髓标本为 4 5 1 2 3 对照 特发性血小板减少性紫癜 12 例 脾功能亢进3 例 伤寒3 例 粟粒性结核 1 例 按年龄将AL 分成三组 即20 岁以下组 16 例 21 60 岁组 40 例 和61 以上岁组 11 例 上述病例均在治疗前采集5 10ml 肝素抗 凝的骨髓 二 标本处理 骨髓标本用pH 7.2 PBS 行四倍稀释 采用淋巴细胞分离液 比密1.077 上海生化试剂厂 行 密度梯度离心 2000 rpm 20min 获单个核细胞 mononuclear cells, MNCs 去红细胞 pH 7.2 PBS 洗涤并调整细 4 3000 rpm 10min Gibcol BRL 公司 胞浓度 分装 每管约含1×10 个MNCs 弃上清 以Trizol 裂解抽提法 提 取总RNA 用 1.5%琼脂糖电泳确定提取物中RNA 的存在 采用Mo-MLV 逆转录酶和Oligo dT16 Promega 公司 以cDNA 第一链合成法合成cDNA -70 保存 三 HGF mRNA 定量测定 采用实时FQ-PCR 进行检测 反应体系 总体积25µl 中含逆转录产物5 µl 10×PCR 缓冲液2.5 µl MgCl2 2.0 mmol/L 上游 下游引物和探针均为0.4µmol/L dNTPs 0.8 mmol/L Taq DNA 聚合酶 Promega 公司 2.5U 运用 7700 Prism 序列检测系统 Perkin Elmer-Applied Biosystem 公司 进行扩增 未加 Taq DN