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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第+二欢学术研讨会
用RT-PCR对环鄱阳湖区家禽及候乌感染
H5亚型禽流感病毒的检测结果与分析
明心中l钟细苟l罗才文l高琳l龚冬免l黄垒星l徐小田I何后军2邓舜洲2郭向东2
(I.江西省动物疫病预防控制中心,江西南昌330006:2.江西农业太擘动物科技学院,江西南昌33∞”)
摘要用砌概对环部阳湖区的牢禽夏候鸟进行了地王型禽流感病毒的捡洲.2005.2006年共检测品
种10个,家禽的泄殖腔和喉气管拂拭干样品1040份,俄鸟的粪便样品288份.候鸟的组织样品21份.结
果表明,所有检测样品均为阴性.没有检测出Hs亚型禽漉感病毒的控酸.由此推断环鄱阳湖区的享禽和候
鸟没有感染或带毒H5亚型禽流感病毒.
关键词R阳cR;郝阳湖区;候鸟:家禽:地亚型禽流感璃毒
禽流感是禽流行性感冒的简称,是由正粘病毒科流感病毒属A型病毒引起的一种禽类
烈性传染病.世界动物卫生组织和我国分别将其列为A类和一类烈性传染病。目前。禽流
感流行的范围和危害之大史无前例,已呈现全球蔓延的趋势。2004年初,我国首次公开报
道广西隆安县丁当镇发生H州l亚型高致病性禽流感。随后,湖北、湖南、广东、云南、河
南、安徽、上海、天津、陕西、甘肃、西藏、新疆等地证实有H,Nl亚型高致病性禽流感发
生。在这期间,江西鹰潭贵溪市、抚州东乡县和南昌青云谱区先后发生了三起疫情,引起全
省各级政府的高度重视.严令各级业务部门做好预防和控制工作。
根据我省的地理环境和候鸟迁徙特点,为有效监测禽流感和形成长效防控机制,及时消
灭传染源。我们从2005年1月至2006年12月连续两年在环都阳湖地区开展了家禽及候鸟
禽流感病原学调查。现报道如下:
1材料与器材
1.1试验材料
1.I.1被捡泄殖腔棉拭子、喉气管棉拭子来自新建、迸贤、南昌、万年、鄱阳、余干、
都昌、星子、湖口、德安、永修、庐山,共青城等13个县(市、区),1040份棉拭子。
1.1.2候鸟栖息地采集新鲜鸟粪棉拭子共计288份.
1.1.3湖区收集刚死亡候鸟21只,无菌采集脑、肺、脾、喉气管等组织备用。
1.2试验器材
II型PcR
精密移液器(0各-1000Ⅲ)、DEPC处理过的1.5札离心管和枪嘴若干、Illlo
仪(Biome帆)、台式高速冷冻离心机(S.GMA2K15)、超纯水器、涡旋器,制冰机、电泳
仪、电泳成像处理分析系统。 .
1.3检测试剂盒
H5亚型禽流感病毒R1.-PCR检测试剂盒(含RNA提取液)购自哈尔滨兽医研究所.
2方法与步骤
2.1ItNA的提取
2.1.1棉拭子装入1.5mL离心管,每管加O.5mL
PBS(加入双抗,要求终浓度l万u),
充分涡旋。洗涤拧干,棉拭子集中高压消毒,5份洗涤液混合于一个5mL灭菌离心管,
8000r/m.m,4℃,5mill,离心,每管取上清液O.5mL,4℃保存备用。每只死鸟都只做为一
份样品处理,取各组织样品适量.混合并进行研磨.再按照每克重量加入1mLPBs,混匀.
按10“比例稀释后用于鼢惧的提取。
2.1.2取1.5mL
DEPc处理过的离心管,加入待检样品100山,加变性液300¨l,继续加
入30Ⅲ2M醋酸钠(pH4.O),反复颠倒离心管4.5次,以混合均匀。
2.1.3加入酚·氯仿:异戊醇混合液300山,小心混合离心管3-5次,置于冰上静止15min。
2.1.4
2.1.5加入300山的异戊醇,置于.20℃静止20分钟,沉淀INA,12000r,min4℃离心
禽类传染病
lOmin。 。
r/mjn
2.1.6弃上清,加入75%的冰乙醇,温和地反复颠倒离心管3.5次,120004℃离
‘
心5min。
2.1.7弃上清,用滤纸吸干管壁余液,真空抽于5.
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