2015苏教版选修1第一节《生物成分的分离与测定技术》word学案.docVIP

第四章 生物化学与分子生物学技术实践 4.1生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化） 探究目的： 1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法 2、了解电泳法分离生物大分子的基本原理 探究预习： 实验操作程序 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； ②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； ③分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 (2)粗分离 ①原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中分子质量较小的杂质。 ②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 ③目的： ④图示： ⑤注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 (3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。 3．结果分析与评价 【解读步骤】 (1)红细胞的洗涤 ①采集血样→②低速短时间离心→③吸取血浆→④盐水洗涤→⑤低速离心→⑥重复④⑤步骤三次。 特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为500 r/min，离心2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。 (2)血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min后，试管中的溶液分为4层： (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。 (4)透析 取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。 2．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 ①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 (2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶) ①固定：将色谱柱垂直固定在支架上? ②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 ③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h (3)样品的加入和洗脱 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ? ②滴加透析样品：用量为1 mL ? ③样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层 ? ④洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱 ? ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集 特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。 材料用具：猪、牛、羊或者其他脊椎动物的血液，离心管，透析袋，凝胶色谱柱，聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置等。 探究过程（）： 探究步骤 探究记录 结论或解释 1.配制试剂 选择相应的化学试剂，配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。 配制巴比妥缓冲液（pH 8.6）1 000 mL（巴比妥2.76 g，，巴比妥钠15.45 g，加蒸馏水定容至1000 mL）；配制染色液100 mL（氨基黑l0B 0.25 g，甲醇50 mL，冰醋酸10 mL，蒸馏水40 mL）；配制漂洗液100 mL（甲醇或乙醇45 mL，冰醋酸5 mL，蒸馏水50 mL）；配制透明液100 mL（无水乙醇:冰醋酸=7:3）。 2.架滤纸桥 按照支架的大小裁剪合适的滤纸条，取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上，即是滤纸桥。 3.浸泡薄膜 用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡20 min。 4.细心点样 取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上