胸腺素TP5-囊素样肽融合基因的克隆、表达与活性检测.pdfVIP

其他论文 胸腺素TP5．囊素样肽融合基因的克隆、表达及活性检测 王臣赵战勤牛明福丁轲刘一尘 李银聚吴庭才张春杰程相朝 (河南科技大学动物传染病与微生物实验室河南洛阳471003) 摘要胸腺素TP5和囊素(BS)作为免疫活性因子，具有重要的免疫学功能，能够刺激淋巴细胞增殖、分化和 成熟，在临床上具有广阔的应用前景，但两者在基因水平的联合应用尚未见报道。为了研究重组胸腺素TP5．囊素样 肽的生物学活性，本研究根据大肠杆菌偏嗜密码子用sOE．PcR合成重组胸腺素TP5．囊素样肽基因，扩增产物经 EcoR I和xhoI双酶切后插入载体pET32a中，通过T4DNA连接酶转入大肠杆菌DH5a，构建重组质粒 肠杆菌中的表达，同时进行诱导表达条件的优化和可溶性表达分析。表达产物经蛋白质Ni柱亲和层析纯化后，进 重组菌株，电泳结果显示诱导的重组菌在24．8l①处出现了与预期相符的明显电泳条带，表明重组胸腺素11P5．囊素 样肽在大肠杆菌中获得了表达；sDs．队GE电泳显示重组胸腺素TP5一囊素样肽能够可溶性表达；MTT试验结果表 明重组的胸腺素TP5．囊素样肽具有生物学活性。细胞样肽PAGE本研究初步研究了重组胸腺素TP5一囊素样肽的免 疫活性，为进一步研究其生物学功能奠定基础。 关键词胸腺素TP5，囊素，融合基因，克隆，表达，活性检测 胸腺素作为一种免疫调节剂，在参与调节免疫细胞及细胞生理活动等一系列过程中旱现功能多 样性，广泛用于医学临床上；囊素作为‘。种新型动物源性免疫增强剂，配合疫苗接种以提高疫苗的 免疫效果，具有广阔的应用前景。然而二者在基因水平卜的联合应用尚未见报道，本研究根据人肠 杆莳偏嗜密码子设计藿组胸腺素TP5．囊素样肽摹冈，构建高效表达胸腺素TP5．囊素样肽的基测上程 菌株，在大肠杆菌中进行融合基因的表达，初步研究重组胸腺索TP5一囊素样肽的免疫活性，为进一 步研究其生物学功能奠定基础。 l材料与方法 1．1实验动物、质粒及菌株 普通级小白鼠10只，体苇约259，4．6周龄，雌雄各半，购自郑州大学第一附属医院；表达载体 pET．32a(+)、大肠杆菌DH5n菌株、大肠杆菌BL21(DE3)I崭株均为本实验室保存。 1．2试剂、工具酶和试剂盒 二硫苏糖醇(DTT)、刀豆蛋白A、溴酚蓝、琼脂糖、考马斯亮蓝R一250、淋巴细胞分离液、 PCRGreenMix、dNTP、 低分子量标准蛋白质Marker、异丙基．B一硫代半乳糖苷(IPTG)、2×Taq PcRBuf衔、NucleicAcidS仃ain核酸染料均购自郑州鼎国生物技术有限责仟公司；DNA小量凝胶 I、勋DI、觑以讥II，T4 DNA聚合酶均购 叫收试剂盒、限制性核酸内切酶点0DR DNA连接酶、Taq 自大连TaKaRa公司；质粒快速提取试剂盒XA012．2购自郑州鼎国生物技术有限公司。标准品胸腺素 TP5、标准晶囊素样肽均由西安华辰生物上程公司合成，纯度大于95％。 1．3胸腺素TP5．囊素样肽基因的设计与合成 根据大肠杆菌偏嗜密码子设计胸腺素TP5一囊素模拟肽串联融合基凶，分别在引物Fl加上艮。尺I 成连接(图1)，保持独市的空问结构的|一时能有效发挥各自的生物学功能。 助 作者简介：王臣(1979一)，男(汉)，安徽霍丘人，博士，副教授。主要从事动物分子病原学与免疫学教学与科研。 E．眦iL：w狮gchen200l@126．com 第四次猪病学术研讨会会议论文集 l胸腺肽TP5· L蛔k蜉 囊素模拟黻 上 GGGGS 图l胸腺素TP5．囊素模拟肽的设计图 所需引物序列如下： GAAGGA TGTGTACCGTAAAGACGTCTATCGCAAG一3’； 引 物 F2 ：